我國北方冬季低溫干燥使得葡萄種植需覆土越冬,這一措施加劇了生態(tài)環(huán)境惡化和導(dǎo)致種植成本增加,因此尋找具有抗寒性的葡萄種質(zhì)資源對于我國北方地區(qū)尤為重要。本研究以抗寒性較強(qiáng)的山葡萄(Vitis amurensis)為試材,通過北方自然低溫生長鍛煉為處理,分別設(shè)定生長期(A,28±1℃)、抗寒初期(B,5±1℃)、抗寒中期(C,0±1℃)、抗寒后期(D,-5±1℃)和深休眠期(E,-10±1℃)共5個時期,測定成熟枝條中糖及其相關(guān)酶活性的變化,并對這5個時期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了大量的差異表達(dá)基因,對VvAGPS1基因在Micro-Tom番茄中進(jìn)行功能驗證。本研究獲得了以下結(jié)果:(1)隨著低溫鍛煉期溫度降低,山葡萄韌皮部枝條中蔗糖和果糖的含量逐漸增加,而葡萄糖出現(xiàn)先增加后降低的趨勢;蔗糖合成酶(SS)的活性逐漸增加;蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性在B時期則顯著下降,此后直至E時期該酶活性變化不顯著;酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)則在C時期有一個活性高峰,此后隨著溫度的降低而降低;ABA含量隨著溫度的降低而增加,IAA則顯著下降。(2)對5個不同低溫鍛煉期山葡萄枝條韌皮部構(gòu)建15個cDNA測序文庫,共獲得了69.34Gb Clean reads,各樣品Clean reads均達(dá)到4.62Gb。通過設(shè)定差異基因表達(dá)閾值,篩選到了8935個差異基因,包括4064(45.48%)個上調(diào)基因和4871(54.53%)個下調(diào)基因;4個低溫鍛煉期與生長期相比,共有的上調(diào)基因為567個,共有的下調(diào)基因為1224個。GO富集分析發(fā)現(xiàn),4個低溫鍛煉期與生長期相比,差異表達(dá)基因主要富集在分子功能中;除DvsA和EvsA在細(xì)胞組分中有富集項外,BvsA和CvsA中均沒有。KEGG分析發(fā)現(xiàn),在p-Value≤0.05水平下BvsA與CvsA中共同富集到的有淀粉和蔗糖代謝、類固醇生物合成及半胱氨酸和蛋氨酸代謝;BvsA與EvsA中共有的富集通路為氨基酸的生物合成及甘露醇代謝;CvsA與EvsA中富集共同的通路為氨基酸的生物合成及花生四烯酸代謝。對主要研究的淀粉和蔗糖代謝通路進(jìn)行分析,結(jié)果共注釋到了147個差異表達(dá)基因,包括73個上調(diào)基因和74個下調(diào)基因。在CvsA、DvsA和EvsA三個組合中共有的上調(diào)差異基因為29個,在4個低溫處理期與生長期相比,共有的下調(diào)差異表達(dá)基因為31個。通過對轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn),MYB的轉(zhuǎn)錄因子富集到的差異基因數(shù)量最多,其次是bHLH,而富集到最少的轉(zhuǎn)錄因子為VOZ和LFY。(3)對淀粉和蔗糖代謝通路研究發(fā)現(xiàn),VvAGPS1基因隨低溫鍛煉期溫度的降低而高表達(dá),因此我們對VvAGPS1基因進(jìn)行了克隆并轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄。VvAGPS1基因全長為2703bp,CDS區(qū)全長1584bp,總氨基酸數(shù)為518,分子式為C_(2608)H_(4130)N_(716)O_(769)S_(23),分子量為58557.20,pI為8.20。將VvAGPS1導(dǎo)入到番茄中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系株高和葉片面積均大于野生型。經(jīng)6℃低溫脅迫0h、12h和24h后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因番茄葉片中蔗糖含量隨脅迫時間增加較野生型顯著升高,葡萄糖含量在野生型番茄中隨脅迫時間增加而下降,而轉(zhuǎn)基因株系中則上升,且轉(zhuǎn)基因株系的死細(xì)胞數(shù)量較野生型的少。POD、SOD和CAT活性在轉(zhuǎn)基因和野生型番茄中均有差異,且隨著脅迫時間增加,轉(zhuǎn)基因株系較野生型的抗氧化酶的活性顯著增加。電導(dǎo)率在轉(zhuǎn)基因株系中比野生型低。低溫脅迫后,VvAGPS1基因表達(dá)隨時間增加而顯著上調(diào),SlAGB1和SlAGB3在24h低溫處理下野生型番茄葉片中較轉(zhuǎn)基因株系中則明顯上調(diào)表達(dá),SlBAM1和SlBAM8則主要在12h下高表達(dá)(β-淀粉酶)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明VvAGPS1在葡萄抗寒中具有重要作用。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：

圖 1-1 非生物脅迫下高等植物細(xì)胞中氧化物的形成（引自 Keunen E et al.，2013）Figure 1-1 The oxide generate in higher plant cells under abiotic stress甜菜堿作為植物非生物脅迫后體內(nèi)代謝保護(hù)物質(zhì)之一，主要是由膽堿脫choline dehydrogenase，CDH）和甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenaDH）催化的反應(yīng)。Park 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將細(xì)菌的 codA 基因轉(zhuǎn)入番茄葉綠體后顯的提高了其在低溫脅迫下的抵御能力，且光合速率也大幅增加，壽命和開花時增加。熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）作為一種脅迫響應(yīng)蛋白，在正常細(xì)胞代中如蛋白質(zhì)合成、定位和降解具有重要作用[15]，且在脅迫條件下能夠有效維持蛋構(gòu)和生物膜完整性，并幫助蛋白質(zhì)重新折疊[16]。H rndahl 等[17]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)葉綠體 HS南芥較野生型相比具有對熱脅迫較高的耐受性。研究發(fā)現(xiàn) sHSPs 在車前草營養(yǎng)器達(dá)是組成型，而愈傷組織中的 sHSPs 則在營養(yǎng)器官胞質(zhì)中不表達(dá)[18]。sHSPs 還在物抗御低溫[19]中起重要作用。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文7圖1-2 糖響應(yīng)不同非生物脅迫下的圖解（引自Smai F et al.，2016）Figure 1-2 Diagrammatic representation of solubles sugars under various abiotic stress不僅如此，可溶性糖作為重要的碳水化物，有效提高原生質(zhì)濃度，降低冰點和減緩胞質(zhì)溶質(zhì)的過渡水解[53]。海藻糖是天然的雙糖中最為穩(wěn)定的一種，并且廣泛分布在自然界的有機(jī)生物中[54]。在對真菌研究中表明，細(xì)胞在正常條件下其含量較為穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞遭受滲透脅迫后則含量發(fā)生顯著變化[55]。在低溫條件下，海藻糖作為一種碳的儲藏形式可分解為葡萄糖為真菌孢子的萌發(fā)和子實體的生長提供能量，且還作為胞質(zhì)的保護(hù)劑從而有效的抵御了極端低溫、輻射和干燥等脅迫環(huán)境[56]。三、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶結(jié)構(gòu)在大多數(shù)植物中淀粉是源葉中主要光合產(chǎn)物貯藏形式。淀粉通過水解成蔗糖通常從源器官向庫器官被動運輸，這一轉(zhuǎn)運過程中轉(zhuǎn)化酶（Invertase

注：不同小寫字母表示不同糖處理水平上差異顯著（p ≤ 0.05）。下同Not:Different small letters means significant difference between treatments （p ≤ 0.05）. The same as below圖 2-1 不同低溫鍛煉期山葡萄枝條中糖含量的變化Figure 2-1 Changes of sugar content in mountain grape shoots during low-temperature stages（二）不同生長鍛煉期山葡萄糖代謝相關(guān)酶活性的變化通過分析不同生長鍛煉期山葡萄糖代謝相關(guān)酶活性的變化發(fā)現(xiàn)（圖 2-2），SPS 的活性在 A 時期與 B、C、D 和 E 四個時期均相比具有顯著差異，而 B、C、D 和 E 時期之間無顯著差異，且活性的高峰出現(xiàn)在 A 時期。AI 的活性高峰出現(xiàn)在 C 時期，在整個低溫鍛煉期隨著溫度的降低表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。C 時期 AI 的活性與其余四個時期之間具有顯著差異，且 D 和 E 之間有顯著差異，而 A、B 和 E 這三個時期之間無顯著差異。SS 的活性在整個低溫鍛煉期顯著增加，在 E 時期最高，且 E 時期與其余四個時期之間均有顯著差異，而 A、B 和 C 兩兩之間無顯著差異，C 與 D 之間無顯著差異。通過分析不同低溫階段與正常生長比較的酶活性發(fā)現(xiàn)（圖 2-2D、E、F），SPS 的增

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 梁國平;山葡萄低溫鍛煉期糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)及VvAGPS1基因的功能鑒定[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號：2827567