番茄(Solanum lycopersicum Mill.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的蔬菜作物,也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。覆蓋于番茄植株表面的表皮毛(trichome)作為番茄應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的第一道屏障,可通過(guò)空間障礙、物理誘捕和化學(xué)毒殺等方式阻礙病毒或病原菌的傳播,減少和抵御昆蟲(chóng)對(duì)植物體的危害,增強(qiáng)植株對(duì)非生物逆境的抗性,對(duì)于番茄的廣譜抗性具有重要作用。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,細(xì)胞骨架(cytoskeleton)在擬南芥表皮毛發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化得到了充分的研究。KCBP(kinesin-like calmodulin-binding protein)作為中心樞紐蛋白同時(shí)結(jié)合微管(microtubules,MTs)與微絲(actin filaments,AFs),從而調(diào)控?cái)M南芥表皮毛形態(tài)建成的關(guān)鍵功能已在模式植物擬南芥中揭示,但相關(guān)研究在番茄中仍鮮有報(bào)道。因此,通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)手段研究番茄表皮毛內(nèi)部細(xì)胞骨架的排布,鑒定番茄表皮毛發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因,解析番茄表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制,對(duì)于提高番茄植株的廣譜抗性具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究構(gòu)建了增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標(biāo)記微管或微絲細(xì)胞骨架的轉(zhuǎn)基因材料,以及敲除SlKCBP的基因編輯材料,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了番茄表皮毛中細(xì)胞骨架的排布狀態(tài),并進(jìn)一步研究了 SlKCBP在番茄表皮毛發(fā)育過(guò)程中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建EGFP標(biāo)記微管或微絲的轉(zhuǎn)基因番茄材料SlTub6-EGFP和Lifeact-EGFP,并利用該材料探索利用激光共聚焦顯微鏡觀察番茄細(xì)胞骨架的方法,成功觀察到番茄表皮細(xì)胞和表皮毛內(nèi)部的細(xì)胞骨架排布,為在番茄中開(kāi)展細(xì)胞骨架相關(guān)研究創(chuàng)造了基礎(chǔ)材料。2.觀察SlTub6-EGFP、Lifeact-EGFP轉(zhuǎn)基因材料的表皮毛類型和形態(tài),結(jié)果表明標(biāo)記了微管或微絲的轉(zhuǎn)基因株系的表皮毛類型和形態(tài)與野生型無(wú)差異,為細(xì)胞骨架標(biāo)記材料的廣泛利用提供可行性依據(jù)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察番茄表皮毛內(nèi)部的細(xì)胞骨架排布,觀察到微管在表皮毛的橫斷面上呈環(huán)狀排布,而微絲則表現(xiàn)為徑向排布,呈束狀。3.通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定、分析番茄中的KCBP蛋白,并進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)番茄基因組進(jìn)行精確編輯,敲除SlKCBP基因,獲得SlKCBP-CRISPR材料。SlKCBP-CRISPR材料在表皮毛的類型及形態(tài)上與野生型無(wú)明顯差異。通過(guò)雜交手段,將SlKCBP-CRISPR材料分別與SlTub6-EGFP、Lifeact-EGFP雜交,獲得EGFP標(biāo)記微管或微絲的SlKCBP基因編輯材料,為深入研究SlKCBP基因在細(xì)胞骨架排布中的作用奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

邐Ｉ緒論逡逑擬南芥表皮毛的發(fā)育過(guò)程如圖１．１所示，表皮毛的形態(tài)發(fā)生表現(xiàn)為單個(gè)表皮細(xì)胞的膨大逡逑（ｂ－１），隨后膨大的表皮細(xì)胞向外延伸形成主干結(jié)構(gòu)（ｂ－２），并以一種固定的方式形成３？４逡逑個(gè)分支（ｂ－３），最后主干和分支擴(kuò)展（ｂ－４），頂端逐漸變尖（ａ－５），表皮毛的表面形成破逡逑璃狀乳突（ｂ－６）邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）。逡逑５邋６邋媻逡逑圖１．１擬南界表皮毛的掃描電鏡圖（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）逡逑表皮毛左邊的數(shù)字表示該表皮毛的發(fā)育階段。（ａ）比例尺＝１００邋ｐｍ。（ｂ）比例尺＝５０邋ｐｍ。逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋＼＼＼ｔ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０００）逡逑Ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｌａｂｅｌｌｅｄ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｉｔｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ，邋（ａ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋｜ｉｍ．邋（ｂ）逡逑Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋５０邋｜ｉｍ．逡逑擬南芥的表皮毛形成的分子機(jī)制已得到深入的研究，該過(guò)程受多個(gè)基因的直接調(diào)控。逡逑擬南芥表皮毛相關(guān)調(diào)控因子主要可分為兩類：一類是對(duì)表皮毛形成起正向調(diào)控作用的逡逑Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋轉(zhuǎn)錄因子邋ＧＬＡＢＲＯＵＳ〗（ＧＬｌ

邐Ｉ緒論逡逑擬南芥表皮毛的發(fā)育過(guò)程如圖１．１所示，表皮毛的形態(tài)發(fā)生表現(xiàn)為單個(gè)表皮細(xì)胞的膨大逡逑（ｂ－１），隨后膨大的表皮細(xì)胞向外延伸形成主干結(jié)構(gòu)（ｂ－２），并以一種固定的方式形成３？４逡逑個(gè)分支（ｂ－３），最后主干和分支擴(kuò)展（ｂ－４），頂端逐漸變尖（ａ－５），表皮毛的表面形成破逡逑璃狀乳突（ｂ－６）邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）。逡逑５邋６邋媻逡逑圖１．１擬南界表皮毛的掃描電鏡圖（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）逡逑表皮毛左邊的數(shù)字表示該表皮毛的發(fā)育階段。（ａ）比例尺＝１００邋ｐｍ。（ｂ）比例尺＝５０邋ｐｍ。逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋＼＼＼ｔ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０００）逡逑Ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｌａｂｅｌｌｅｄ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｉｔｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ，邋（ａ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋｜ｉｍ．邋（ｂ）逡逑Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋５０邋｜ｉｍ．逡逑擬南芥的表皮毛形成的分子機(jī)制已得到深入的研究，該過(guò)程受多個(gè)基因的直接調(diào)控。逡逑擬南芥表皮毛相關(guān)調(diào)控因子主要可分為兩類：一類是對(duì)表皮毛形成起正向調(diào)控作用的逡逑Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋轉(zhuǎn)錄因子邋ＧＬＡＢＲＯＵＳ〗（ＧＬｌ

１．１．２．１煙草表皮毛的研究進(jìn)展逡逑煙草的表皮毛是一種多細(xì)胞表皮毛，根據(jù)其是否有腺體，可分為有腺體和無(wú)腺體兩大逡逑類（Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，１９８８），根據(jù)形態(tài)細(xì)分可分為五種類型，共９種形態(tài)（圖１．３，劉金秋，逡逑２０１７）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，煙草腺體毛（ｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅ）的數(shù)量約占煙草所有表皮毛數(shù)量的８６°／0，逡逑這說(shuō)明煙草腺體毛在煙草的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用。逡逑ｉｉｖｉｉｉｉＬ逡逑１２邐３邐７邐８邐ｑ逡逑注：１－２．單列保護(hù)毛；３．分叉保護(hù)毛：４－７．腺毛；８．分叉腺毛：９．短柄腺毛逡逑圖１．３煙草表皮毛形態(tài)（劉金秋，２０１７）逡逑Ｆｉｇ邋１．３邋Ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ｔｏｂａｃｃｏ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ邋（Ｌｉｕ，邋２０１７）逡逑煙草表皮毛與擬南芥表皮毛相比，類型更加多樣，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。形態(tài)上的這些差異逡逑也暗示了二者表皮毛發(fā)育過(guò)程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的差異。研究表明，將金魚(yú)草逡逑（ｄ油＞ｒ／７／ｍ洲／而力《）的Ｒ２Ｒ３邋ＭＹＢ類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控基因ＭＬｍ和ＭＬｍＺＪ／Ｚ／轉(zhuǎn)入逡逑煙草中，能夠使煙草子葉、葉片和莖上的表皮毛數(shù)量明顯增加（Ｐｅｒｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，２００５）。逡逑而在煙草中超表達(dá)ＧＬ／基因?qū)χ仓瓯砥っ念愋秃蛿?shù)量均未產(chǎn)生影響，在擬南芥表皮毛逡逑缺失突變體發(fā)／／－／中超表達(dá)Ａ／／ＡＴ４基因也不能使其表型恢復(fù)（Ｐａｙｎｅｅｔａｌ．

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本文編號(hào)：2827067