花香是觀賞植物的重要特征之一,對(duì)植物的生存繁殖有重要意義,其產(chǎn)品在食品、保健、化工等方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中國的傳統(tǒng)名花,能釋放愉悅的香氣,深受中國人民的喜愛。本課題組前期研究表明,丁子香酚是梅花的特征香氣成分之一。松柏醇酰基轉(zhuǎn)移酶(CFAT)和丁子香酚合酶(EGS)參與丁子香酚的生物合成途徑的最后兩步,CFAT是丁子香酚代謝與木質(zhì)素代謝分開的節(jié)點(diǎn)基因。而目前對(duì)CFAT的研究很少,梅花丁子香酚代謝的研究剛剛起步。本論文采用生物信息學(xué)方法對(duì)梅花基因組中的候選CFAT進(jìn)行了分析和鑒定,以梅花品種'三輪玉碟'為試驗(yàn)材料,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)首次在梅花中克隆得到松柏醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因,通過生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式分析、原核表達(dá)以及真核表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化對(duì)其功能進(jìn)行了初步探索,主要結(jié)果如下:1.經(jīng)BlastP檢索從梅花基因組數(shù)據(jù)庫中獲得86個(gè)候選CFAT,其在進(jìn)化上分為五大分枝,根據(jù)對(duì)序列、保守基序和進(jìn)化關(guān)系的分析,初步預(yù)測第Ⅱ分枝的Pm030674、Pm013138、Pm030672、Pm023001可能是梅花的松柏醇�；D(zhuǎn)移酶基因。經(jīng)克隆得到3個(gè)松柏醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的全長cDNA,分別命名為PmCFA T1a、PmCFA T1b、PmCFA T2,其序列全長均為1383bp,編碼460個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量分別為51.61 kDa、51.54 kDa、50.92 kDa,屬于不穩(wěn)定的酸性蛋白。PmCFA T1a、PmCFAT1b是Pm030674在'三輪玉碟'中的等位基因。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,PmCFATs與已鑒定的松柏醇�；D(zhuǎn)移酶功能基因具有較高的同源性。2.利用pSuper1300-GFP構(gòu)建了 PmCFATs的GFP融合表達(dá)載體,通過在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示:PmCFAT1a、PmCFAT1b、PmCFAT2均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。3.應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)PmCFA Ts在'三輪玉碟' 6個(gè)不同開花時(shí)期和5個(gè)不同部位中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PmCFA T1主要在雄蕊和花瓣中表達(dá),在葉片中無表達(dá);其表達(dá)量隨開花進(jìn)程上升,盛花期達(dá)到最高,后開始下降,與丁子香酚的釋放規(guī)律有很強(qiáng)的相關(guān)性,推測PmCFA T1作為PmEGS2上游的關(guān)鍵基因,參與了丁子香酚的合成。PmCFA T2在葉片中的表達(dá)量高于花朵,在各部位和開花進(jìn)程中的表達(dá)均不符合丁子香酚的合成、釋放規(guī)律。4.利用pET-28b構(gòu)建了 PmCFA T1a、PmCFAT1b、PmCFAT2的原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中成功表達(dá)出與預(yù)測分子量相符的蛋白,大小分別約為52 kDa、52 kDa、51 kDa。融合蛋白以包涵體形式表達(dá),當(dāng)使用優(yōu)化誘導(dǎo)條件:0.2 mM的IPTG,16℃誘導(dǎo)14h時(shí),蛋白溶解性有所提高,但大部分仍形成了包涵體。利用pCHF3301構(gòu)建了 PmCFA T1a、PmCFA 71b、PmCFA T2、PmEGS2的單基因植物表達(dá)載體和雙基因植物表達(dá)載體 pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT1a、pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT1b、pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT2,以及潮霉素篩選抗性植物表達(dá)載體pSuper1300-PmCFA T1a、pSuper1300-PmCFAT1b、pSuper1300-PmCFAT2,并對(duì)矮牽牛進(jìn)行了初步轉(zhuǎn)化和Basta篩選。本研究對(duì)梅花松柏醇�；D(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了克隆,表達(dá)分析和功能的初步探索,為進(jìn)一步分析基因功能,理清梅花丁子香酚的代謝通路,以及深度挖掘梅花BAHD家族基因奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S685.17;Q943.2
【部分圖文】：

－邐引言逡逑酸解l#酶（ｐｈｂｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）催化生成反式肉桂酸（ｄ，ＣＡ）。可見；ＰＡＬ與ＰＡＡＳ兩種酶共同競爭底物苯丙l#酸。苯環(huán)成屬于反式肉桂酸分枝，是通過將反式肉桂酸丙基側(cè)鏈的Ｃ２單元方式為Ｐ氧化，非Ｐ－氧化或兩者結(jié)合的方式（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，２００４；０ｒｌ氧化途徑己在矮牽�；ㄖ斜煌耆U明，其過程類似于脂肪酸的分解過氧化物酶體（Ｋｌｅｍｐｉｅｎｅｔａｌ．，２０１２；邋Ｑｕａｌｌｅｙｅｔａｌ．，２０１２）。苯甲酸的關(guān)鍵中間體，經(jīng)苯甲醛脫氫酶氧化生成苯甲酸（Ｌｏｎｇｅｔａｌ．２００９）苯甲醛合成的酶促反應(yīng)仍然未知。苯丙素類化合物（Ｃ６－Ｃ３）如：）、異丁子香釀（ｓｉｏｅｕｇｅｎｏｌ）、甲基丁子香}（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）、ｅｔｈｙｌｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）等的生物合成是反式肉桂酸生成的Ｐ－香豆酸，經(jīng)柏醇，進(jìn)而合成各種具有揮發(fā)性的苯丙素物質(zhì)。苯丙素代謝的一些到花青素代謝和木質(zhì)素代謝中，各種代謝物質(zhì)相互影響，涉及多種的代謝網(wǎng)絡(luò)（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑１邋－

（ＶａｎＭｏｅｒ－ｋｅｒｃｋｅｅｔａｌ．，邋２０１１）。Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｎ邋等人（２０１２）發(fā)現(xiàn)位于邐下游逡逑的五ａｓ邋／通過正向調(diào)節(jié)和花香結(jié)構(gòu)基因來調(diào)控花香產(chǎn)物的合成，而ＯＤＯ／對(duì)逡逑五０５／具有負(fù)調(diào)控作用。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如圖１－２所示（Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｏｎｅｔａｌ．，２０１２）。逡逑６逡逑

異丁子香酚的苯環(huán)上可能發(fā)生進(jìn)一步修飾，如甲基化、異戊烯基化或形成逡逑亞甲基橋等，如在氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（ｆｆｉＭＴ）作用下生成甲基化產(chǎn)物甲基丁子香酚逡逑（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）或甲基異子丁香酌（ｍｅｔｈｙｌ－ｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）（見圖１－１），這些修飾反逡逑應(yīng)以及ＥＧＳ、ＩＧＳ對(duì)底物的競爭增加了丁子香酚代謝的復(fù)雜性。逡逑邐？邋ＢＫｉｎｔｎｃｘｄｗｏＭｌＩｎｔＣＭＩｌ逡逑／／邋Ｐｔｗｎｙｌａｉａｎｉｎ＊邐Ｃｔｎｎｗｎｔｃ邋＊ｃｔｄ逡逑Ｐｈｃｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｔｄ邋ｖｏｌａｔｉｌｅ邋（Ｃ６－Ｃ２）逡逑ｐ－Ｃｏｕ？ｎＭｔｃ邋Ｋｉｄ邐Ｖ＊ｎＵｌｔｎ邋（Ｃ６＊Ｃ１＞逡逑ｔ邐？逡逑%煎危耍灣危桑茫浚危懾義弦灰還郟櫻硬峰義希穡�？ｕｍ＊}錚歟茫錚鈴危茫幔媯歟澹錚戾澹茫錚鈴巍澹澹�？ｎｉ�

本文編號(hào)：2825740