株高(Plant height)是決定作物和園藝植物產(chǎn)量、品質(zhì)的重要性狀之一,而矮化對(duì)觀賞植物是一種有益性狀。百子蓮(Agapanthus praecox ssp.orientalis)原產(chǎn)南非,是一種觀賞價(jià)值很高的多年生根莖類花卉,幼苗階段的株高主要體現(xiàn)為葉長(zhǎng),成年階段則為花葶(花序軸)高度。本人所在的研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)百子蓮進(jìn)行了矮化調(diào)控的研究,發(fā)現(xiàn)赤霉素(Gibberellin,GA)是決定百子蓮株高的重要激素,但對(duì)其調(diào)控機(jī)理的研究較少。本研究首先對(duì)比了外源GA_4和GA合成抑制劑多效唑(Paclobutrazol,PAC)對(duì)百子蓮1年生幼苗和5年生成年植株高度的調(diào)控效果和生理差異;然后利用比較轉(zhuǎn)錄組(Comparative transcriptome)數(shù)據(jù)對(duì)調(diào)控效果最顯著的花葶的矮化機(jī)制進(jìn)行分析,并篩選出調(diào)控株高的關(guān)鍵基因?yàn)镚A合成酶ApGA20ox1;通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)抑制該基因表達(dá)得到矮化的轉(zhuǎn)基因植株;最后運(yùn)用形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和比較蛋白質(zhì)組學(xué)(Comparative proteomics)數(shù)據(jù)構(gòu)建了GA調(diào)控百子蓮株高建成的分子網(wǎng)絡(luò)。主要結(jié)果概述如下:(1)分別用外源400 mg·L~(-1) GA_4和PAC處理1年生和5年生百子蓮植株,研究了外源GA信號(hào)對(duì)該物種株高的調(diào)控效果以及生理基礎(chǔ)。外源GA對(duì)百子蓮株高有小幅促進(jìn),但調(diào)控效果不顯著;光合速率、葉綠素含量沒有明顯改變,但幼苗葉片和成年植株花葶中淀粉含量分別顯著減少8.70%和42.28%,花葶可溶性糖含量顯著減少11.99%,幼苗葉片和成年植株花葶脂肪酸的含量顯著降低16.26%和21.31%。而PAC可導(dǎo)致百子蓮顯著矮化,使幼苗葉長(zhǎng)較對(duì)照顯著減少52.40%,成年植株葉長(zhǎng)和花葶高度分別顯著降低36.22%和54.56%;細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),PAC主要抑制了細(xì)胞長(zhǎng)軸尺寸,將幼苗葉片、成年植株葉片和花葶細(xì)胞長(zhǎng)度分別顯著減少36.10%、31.27%和50.91%,而對(duì)細(xì)胞寬度影響較小;PAC使幼苗和成年植株葉綠素含量增加29.92%和18.45%,凈光合速率增加14.99%和21.16%,導(dǎo)致幼苗葉片和成年植株花葶淀粉含量分別增加18.98%和30.68%,可溶性糖含量增加68.08%和17.81%。外源調(diào)控結(jié)果表明:PAC比GA能更有效調(diào)控株高,尤其是花葶的高度,GA信號(hào)同時(shí)調(diào)控了同化產(chǎn)物的積累。(2)將PAC處理的矮化花葶與對(duì)照組織進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組分析,得到花葶矮化相關(guān)的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)共2838個(gè),主要富集在激素合成與代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞周期與分裂、細(xì)胞壁的合成與修飾等通路中。進(jìn)一步將花葶上、中和下部的細(xì)胞尺寸、GAs(GA_1、GA_3、GA_4)和吲哚乙酸(Indole acetic acid,IAA)含量、淀粉和蔗糖含量、細(xì)胞壁組分以及相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,GA_4是百子蓮花葶中主要的GAs組分,矮化花葶GA_1、GA_3和GA_4含量較對(duì)照分別顯著降低3.41~65.43%、5.06~61.43%和59.5~92.0%,IAA的濃度梯度顯著降低,頂部/底部濃度比值由14.57降為1.77。相關(guān)性分析顯示,GAs含量調(diào)控了花葶細(xì)胞長(zhǎng)軸尺寸(相關(guān)系數(shù)0.822),而IAA調(diào)控了細(xì)胞周期基因Cyclin-SDS(相關(guān)系數(shù)0.980)的表達(dá),造成細(xì)胞數(shù)量減少10.45%。矮化花葶細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分纖維素和半纖維素含量提高,而細(xì)胞壁松弛酶基因木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶2(Xyloglucan endotransglycosylase2,XET2)和for touch(TCH4)表達(dá)下調(diào)超過99.99%,限制了細(xì)胞壁長(zhǎng)軸方向的大小。XET2(相關(guān)系數(shù)0.814)和TCH4(相關(guān)系數(shù)0.897)表達(dá)受到GA_4含量的調(diào)控,矮化花葶中GA20ox1顯著上調(diào)表達(dá)2.54(log_2),而GA_4的合成受GA20ox1基因的調(diào)控(相關(guān)系數(shù)-0.870),表明GA20ox1基因可能是調(diào)控百子蓮株高的一個(gè)關(guān)鍵基因。(3)利用RACE技術(shù)獲得ApGA20ox1基因全長(zhǎng),該基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,cDNA全長(zhǎng)1386 bp,開放閱讀框(Opening reading frame,ORF)為1086 bp,編碼361個(gè)氨基酸殘基。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,ApGA20ox1與單子葉植物GA20ox聚為一類,進(jìn)化關(guān)系保守。ApGA20ox1基因表達(dá)具有顯著的空間特異性,在根尖、未成熟種子、莖、花葶中表達(dá)量較高,表明該基因主要參與百子蓮的生長(zhǎng)和發(fā)育。利用煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn),ApGA20ox1主要定位于細(xì)胞質(zhì)。在擬南芥中過表達(dá)ApGA20ox1基因分別使Col-0葉長(zhǎng)和高度較對(duì)照顯著增加21.77%和20.74%,證實(shí)了ApGA20ox1具有調(diào)控株高的預(yù)期生物活性。(4)利用ApGA20ox1基因RNAi得到了矮化的百子蓮幼苗,2年生幼苗葉片中ApGA20ox1表達(dá)下調(diào)39.48%,使葉片長(zhǎng)度顯著降低55.59%,表明ApGA20ox1能有效調(diào)控百子蓮株高。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),RNAi植株的矮化表型主要是由于細(xì)胞長(zhǎng)度減小了44.03%所致。對(duì)RNAi矮化幼苗進(jìn)行GAs回補(bǔ),外源GA_4可以恢復(fù)RNAi矮化幼苗的表型,葉長(zhǎng)生長(zhǎng)增量為不加GA_4的3.08倍,表明矮化表型是由于RNAi抑制GAs合成導(dǎo)致的。矮化幼苗的GA_1、GA_3和GA_4含量分別降低了37.49%、53.82%和49.68%。此外,油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)和(Jasmonate,JA)含量也降低了48.28%和39.88%,而IAA含量升高了207.04%,淀粉和可溶性糖的含量顯著增加48.69%和120.38%,表明GA信號(hào)調(diào)控了其他激素和糖的合成與代謝。(5)利用iTRAQ技術(shù)鑒定得到RNAi矮化植株差異表達(dá)蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs)55個(gè),DEPs主要富集在激素合成與代謝、碳水化合物代謝、次生代謝過程、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及脅迫響應(yīng)等通路中,與花葶矮化RNA-seq結(jié)果基本一致。Pathway分析表明,GA信號(hào)作為主要因子,調(diào)控并協(xié)同生長(zhǎng)素、BR和JA等激素信號(hào),共同決定了百子蓮幼苗株高建成。轉(zhuǎn)錄和蛋白數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析中,DEGs和DEPs主要參與糖的合成與代謝、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成與降解。果糖-1,6-二磷酸酶、果糖-6-磷酸酶、α-半乳糖苷酶和α-葡糖苷酶等蛋白的上調(diào)表達(dá),共同加強(qiáng)了糖的合成和代謝,作為前體底物參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成,纖維素合成酶、己四醇醛酸脫羧酶和1,4-β-木糖苷酶加強(qiáng)了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成,而XET2和TCH4表達(dá)受抑制導(dǎo)致細(xì)胞壁修飾和降解過程減弱,細(xì)胞壁由于可塑性降低導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的減小,使百子蓮株高矮化�；谝陨辖Y(jié)果,推測(cè)并構(gòu)建了GA信號(hào)調(diào)控百子蓮株高的群集調(diào)控網(wǎng)絡(luò),初步揭示了GA調(diào)控百子蓮株高建成的分子機(jī)理。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S682.29

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2819616