碳是植物細(xì)胞的重要組成物質(zhì),作為能量供應(yīng)植物生長(zhǎng)。植物將外源碳轉(zhuǎn)化為糖并合成其他物質(zhì),糖可作為內(nèi)源信號(hào)來調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。前人研究表明外源碳與葡萄試管苗生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切,為進(jìn)一步研究外源碳調(diào)控葡萄試管苗生長(zhǎng)的分子機(jī)理,本試驗(yàn)以葡萄“黑比諾”(V.vinifera L.)試管苗為材料,利用外源CO_2(1000±40μmol·mol~(-1))和蔗糖(2%)處理葡萄試管苗。通過以下4個(gè)生長(zhǎng)條件進(jìn)行處理:S0:GS培養(yǎng)基,含0.1mg·L~(-1) IAA,不含蔗糖,環(huán)境CO_2(380±40μmol·mol~(-1));Cs:含0.1mg·L~(-1) IAA和2%蔗糖,高濃度CO_2(1000±40μmol·mol~(-1)),GS培養(yǎng)基;C0:含0.1mg·L~(-1) IAA的GS培養(yǎng)基,不含蔗糖但高濃度CO_2;S1:GS培養(yǎng)基,含0.1mg·L~(-1) IAA,含2%蔗糖,環(huán)境CO_2濃度。結(jié)合葡萄試管苗生長(zhǎng)生理變化,通過RNA-seq和iTRAQ技術(shù)分析不同外源碳引起的葡萄試管苗轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組表達(dá)差異,聯(lián)合兩個(gè)組學(xué)分析外源碳對(duì)葡萄試管苗生長(zhǎng)相關(guān)功能基因及分子機(jī)理的調(diào)控作用,主要研究結(jié)果如下:1.不同外源碳處理對(duì)葡萄試管苗各項(xiàng)生理指標(biāo)影響不同。高濃度CO_2能夠提高試管苗葉片相對(duì)電子傳遞速率(ETR)和光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP),降低非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ),進(jìn)而影響試管苗葉片氣孔導(dǎo)度,顯著降低蒸騰速率,顯著增加葉片凈光合速率,促進(jìn)光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,提高光能利用率。高CO_2還能促進(jìn)試管苗葉面積、生物量增加。而試管苗葉片可溶性蛋白、可溶性糖以及葉綠素的變化可能受培養(yǎng)基糖含量影響,與高CO_2濃度不相關(guān)。外源碳處理后試管苗葉片GA和ZR含量相比無碳處理顯著增加,高濃度CO_2葉片ABA含量顯著低于正常CO_2處理,IAA在不同碳處理間無顯著變化。2.外源碳通過乙烯信號(hào)通路調(diào)控葡萄試管苗的生長(zhǎng)。通過對(duì)葡萄試管苗“黑比諾”四個(gè)處理轉(zhuǎn)錄組與蛋白組數(shù)據(jù)分析,Cs、C0及S1處理分別與CK相比較,共鑒定到70個(gè)顯著差異基因和65個(gè)顯著差異蛋白。根據(jù)生物學(xué)功能及生理特性鑒定到8個(gè)顯著差異基因及2個(gè)差異蛋白與乙烯信號(hào)過程相關(guān)。乙烯相關(guān)差異基因分別為:ERF5(LOC100244353、LOC100247763、LOC100254616及LOC100261260),ERF105(LOC100249507、LOC100259725),ERF2(LOC100254640)以及CTr(CTr7)。2個(gè)顯著差異蛋白分別為:S-adenosylmethionine synthase 5(SAM synthase 5;XP_002280106.1)and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase 2(ACC oxidase 2;NP_001267871.1)。轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析表明外源碳通過調(diào)控ACC oxidase 2抑制乙烯生物合成。而上調(diào)表達(dá)的CTr7和ERF5與乙烯信號(hào)途徑相關(guān)。外源碳通過乙烯信號(hào)途徑調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng),但是抑制了乙烯的生物合成。3.高濃度CO_2通過影響RbcS與Rca的轉(zhuǎn)錄與翻譯促進(jìn)葡萄試管苗光合作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析葡萄試管苗“黑比諾”不同處理,通過Cs、C0與S1分別比較,在高CO_2條件下共富集到1814個(gè)顯著差異基因(465個(gè)上調(diào)表達(dá),1349個(gè)下調(diào)表達(dá))和172個(gè)顯著差異蛋白(80個(gè)上調(diào)表達(dá),97個(gè)下調(diào)表達(dá))。GO分析與KEGG分析,富集得到三條顯著變化的通路:光合天線蛋白通路、光合作用及代謝通路。光合天線蛋白通路中包含9個(gè)差異蛋白、光合作用包含6個(gè)差異蛋白,而代謝通路包含48個(gè)差異蛋白。高CO_2條件試管苗葉面積、株高、qP、ΦPSII及ETR相比對(duì)照都增加,而Fv/Fm與NPQ相比對(duì)照下降。這些生理指標(biāo)的變化與差異蛋白的功能有關(guān)。通過組學(xué)聯(lián)合分析表明高CO_2對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程有不同的影響。高CO_2引起RbcS與Rca上調(diào)表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)試管苗光合作用,加速了葡萄試管苗有自養(yǎng)型向異養(yǎng)型轉(zhuǎn)化。4.高CO_2能夠影響葡萄試管苗次生代謝。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析高CO_2條件葡萄試管苗“黑比諾”不同處理,在Cs versus S1比較組中共有748個(gè)差異基因(116個(gè)上調(diào)表達(dá),632個(gè)下調(diào)表達(dá)),共有115個(gè)差異蛋白(48個(gè)上調(diào)表達(dá),67個(gè)下調(diào)表達(dá))。在C0 versus S0比較組中共有379個(gè)差異基因(174個(gè)上調(diào)表達(dá),205個(gè)下調(diào)表達(dá)),共有125個(gè)差異蛋白(31個(gè)上調(diào)表達(dá),94個(gè)下調(diào)表達(dá))。對(duì)差異基因及差異蛋白通過GO及KEGG分析,富集到類黃酮代謝途徑顯著變化。其中CHS、F3H、FAOMT及flavonoid-3,5'-hydroxylase等類黃酮代謝途徑相關(guān)酶基因大量表達(dá),stilbene synthase大量下調(diào)表達(dá),同時(shí)在蛋白質(zhì)組中CHS顯著上調(diào)表達(dá)。說明高CO_2可能促進(jìn)植物次生代謝中的苯丙烷代謝向類黃酮、花青素代謝途徑轉(zhuǎn)移,而抑制了植物二苯乙烯類物質(zhì)合成。5.根據(jù)前文研究結(jié)果,選擇與乙烯信號(hào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ERF5及糖代謝相關(guān)GDP-L-半乳糖磷酸化酶兩個(gè)基因進(jìn)行克隆及瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建。通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位�？寺RF5、GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因片段并進(jìn)行測(cè)序鑒定,構(gòu)建得到P-1300-GFP-ERF與P-1300-GFP-G瞬時(shí)表達(dá)載體后,進(jìn)行洋蔥表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位及煙草葉片外植體轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明兩個(gè)基因在細(xì)胞中的定位與預(yù)測(cè)一致。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S663.1


本文編號(hào)：2815947