【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)是極具觀賞價(jià)值的園藝作物,花色是其重要經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)�；ㄇ嘬帐羌t色系菊花的主要色素,其合成受外界環(huán)境和自身遺傳調(diào)控。前人研究表明,MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種植物花青苷代謝,然而菊花花青苷代謝調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控機(jī)理仍不十分明晰。本文在前期鑒別出調(diào)控花青苷代謝激活型CmMYB6成員基礎(chǔ)上,以不同顏色早小菊‘Z1'(深紅色)、‘Z2'(粉色)、‘Z3'(黃色)、白色切花菊‘Jimba’(WJ)和變紅‘Jimba’(TRJ)為材料,分離鑒別了參與菊花花青苷代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵成員CmbHLH2,以及參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控TRJ花青苷代謝的抑制型成員CmMYB#7。主要研究結(jié)果如下:1、鑒別菊花花青苷代謝關(guān)鍵CmbHLH2轉(zhuǎn)錄因子。利用菊花EST數(shù)據(jù)庫,通過進(jìn)化分析和序列比對(duì)分離得到參與菊花花青苷代謝的bHLH轉(zhuǎn)錄因子CmbHLH2,其表達(dá)在三種不同色系早小菊'Z1'、'Z2’和'Z3'中與花青苷代謝結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呈正相關(guān)。啟動(dòng)子誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CmbHLH2能與CmMYB6協(xié)同激活CmDFR啟動(dòng)子。酵母雜交實(shí)驗(yàn)表明,CmbHLH2和CmMYB6均能結(jié)合CmDFR啟動(dòng)子序列,且CmbHLH2可與CmMYB6發(fā)生蛋白互作形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。瞬時(shí)過表達(dá)CmbHLH2和CmMYB6能誘導(dǎo)煙草葉片花青苷累積。2、篩選獲得菊花花青苷代謝相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,克隆獲得91個(gè)在‘Jimba'菊花花瓣中表達(dá)的MYBs轉(zhuǎn)錄因子家族成員。分析了WJ和TRJ中差異表達(dá)的MYBs轉(zhuǎn)錄因子,從中篩選出表達(dá)差異倍數(shù)大于4的MYBs,其中,CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#39和CmMYB#85在 TRJ 中的表達(dá)高于WJ;CmMYB#7和CmMYB#15在TRJ中的表達(dá)低于WJ。分析這6個(gè)MYBs轉(zhuǎn)錄因子在TRJ三種不同著色程度花瓣(內(nèi)層白色花瓣、中層尖紅花瓣、外層全紅花瓣)中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),除CmMYB#39外,CmMYB#17、CmMYB#16 CmMYB#39和CmMYB#85表達(dá)與花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呈正相關(guān)。CmMYB#7和CmMYB#15的表達(dá)與花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。將這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作為參與花青苷代謝調(diào)控研究的候選MYBs。3、闡明了 R3型MYB抑制子CmMYB#7調(diào)控菊花花青苷代謝分子機(jī)制。對(duì)上述 5 個(gè)候選 MYBs CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#85、CmMYB#7 和CmMYB#15進(jìn)行啟動(dòng)子誘導(dǎo)效應(yīng)分析,結(jié)果表明,它們均不能單獨(dú)激活或抑制花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動(dòng)子,當(dāng)與CmMYB6和CmbHLH2混合時(shí),CmMYB#7可抑制CmMYB6-CmbHLH2復(fù)合體對(duì)結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動(dòng)子的激活效應(yīng)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)、定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)及熒光素酶互補(bǔ)成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CmMYB#7通過與CmbHLH2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,從而抑制CmMYB6-CmbHLH2復(fù)合體對(duì)花青苷結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。綜上所述,本研究鑒別得到了 1個(gè)參與菊花花青苷代謝的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,即CmbHLH2,可與花青苷激活子CmMYB6協(xié)同增強(qiáng)花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而促進(jìn)花青苷合成;鑒別獲得了 1個(gè)R3型花青苷抑制子CmMYB#7,可與CmMYB6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CmbHLH2抑制菊花花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,參與TRJ花青苷代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S682.11
【圖文】：

２０１４）進(jìn)行全長(zhǎng)克隆。逡逑進(jìn)化分析結(jié)果表明，與已報(bào)道花青苷合成Ｉｌｌｆ亞族ｂＨＬＨｓ聚類到逡逑同一分支（圖２．１Ｂ），ＣｍｂＨＬＨ２與大麗花ＤｖｌＶＳ氨基酸序列相似度為６４％，ＤｖＪＦＳ逡逑已報(bào)道參與大麗花花青苷合成（Ｏｈｎｏ等，２０１１）。其與擬南芥ＴＴ８氨基酸序列逡逑相似度達(dá)５９％，ＴＴ８能與擬南芥ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子ＰＡＰ１結(jié)合形成復(fù)合體調(diào)控花青逡逑苷合成（Ｄｕｂｏｓ等，２０１０）。ＣｍｂＨＬＨｌ則聚類到其他分支。逡逑結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，ＣｍｂＨＬＨｌ和ＣｍｂＨＬＨ２包含一個(gè)螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)逡逑１７逡逑

三個(gè)品種早小菊‘ｚｒ，邋ｆＺ２’和‘Ｚ３’分別呈深紅色、粉紅色和黃色（圖逡逑２．２Ａ）�；ò昕偦ㄇ嘬蘸窟M(jìn)行測(cè)定結(jié)果，Ｚ１’花青苷含量為２．８３邋ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ２’逡逑花青苷含量為０．０８ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ３’中檢測(cè)不到花青苷（圖２．２Ｂ）。結(jié)果表明，花逡逑青苷含量差異是三個(gè)早小菊品種花色差異的原因之一。逡逑２０逡

ｐｌａｎｔ邋ｃａｒｅ在線軟件分析啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)域包含ＭＹＢ結(jié)合元逡逑件ＭＢＳ邋（ＭＹＢ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ），及真核生物轉(zhuǎn)錄起始ＲＮＡ聚合酶結(jié)合位點(diǎn)ＴＡＴＡ逡逑盒，另外還包含一些響應(yīng)光調(diào)控的順式作用元件（圖２．４）。逡逑ＴＡＴＡ逡逑邐▲邋■邋▲邋■邋■邐？—逡逑－７６９邋ｂｐ邐－８０邋ｂｐ逡逑圖２．４邋ＣｍＤ／Ｗ啟動(dòng)子順式作用元件分析逡逑圓形表示ＴＡＴＡ盒，三角形表示ＭＹＢ識(shí)別元件，正方形表示ｂＨＬＨ識(shí)別元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｏｆ邋ＣｍＤＦＲ逡逑Ｃｉｒｃｌｅ邋ｍｅａｎｓ邋ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，邋ｔｒｉａｎｇｌｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ＭＹＢ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ，邋ｓｑｕａｒｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ｂＨＬＨ逡逑ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑２．２．５邐ＣｍｂＨＬＨ２協(xié)同ＣｍＭＹＢ６結(jié)構(gòu)基因ＯｗＤ／７？啟動(dòng)子逡逑為進(jìn)一步研究ＣｗＷｉＺＪ／７和功能，將其分別構(gòu)建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋００２９逡逑６２－ＳＫ表達(dá)載體，將ＯｍＤＦＴ？啟動(dòng)子構(gòu)建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋０８００－ＬＵＣ載體，利用雙僁逡逑光素酶實(shí)驗(yàn)體系分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子是否存在調(diào)控作用。將和逡逑單獨(dú)或混合注射本氏煙草，結(jié)果表明Ｃｗ和逡逑均不能單獨(dú)激活或抑制結(jié)構(gòu)基因ＣｗＤＦ／？啟動(dòng)子。當(dāng)與花青苷激活子逡逑（Ｌｉｕ等，２０１５邋）混合后，能顯著增強(qiáng)Ｃ／ＷＭ７５６對(duì)ＣｗＤＦｉ？啟動(dòng)子激逡逑活效應(yīng)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 葛翠蓮;黃春輝;徐小彪;;果實(shí)花青素生物合成研究進(jìn)展[J];園藝學(xué)報(bào);2012年09期

2 戴燦;苗聰秀;盧光t;;基于重疊延伸PCR法的定點(diǎn)突變技術(shù)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年03期

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本文編號(hào)：2803549