【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)是極具觀賞價值的園藝作物,花色是其重要經濟性狀指標�；ㄇ嘬帐羌t色系菊花的主要色素,其合成受外界環(huán)境和自身遺傳調控。前人研究表明,MYB和bHLH轉錄因子參與調控多種植物花青苷代謝,然而菊花花青苷代謝調控關鍵轉錄因子及調控機理仍不十分明晰。本文在前期鑒別出調控花青苷代謝激活型CmMYB6成員基礎上,以不同顏色早小菊‘Z1'(深紅色)、‘Z2'(粉色)、‘Z3'(黃色)、白色切花菊‘Jimba’(WJ)和變紅‘Jimba’(TRJ)為材料,分離鑒別了參與菊花花青苷代謝轉錄調控的關鍵成員CmbHLH2,以及參與轉錄調控TRJ花青苷代謝的抑制型成員CmMYB#7。主要研究結果如下:1、鑒別菊花花青苷代謝關鍵CmbHLH2轉錄因子。利用菊花EST數據庫,通過進化分析和序列比對分離得到參與菊花花青苷代謝的bHLH轉錄因子CmbHLH2,其表達在三種不同色系早小菊'Z1'、'Z2’和'Z3'中與花青苷代謝結構基因表達呈正相關。啟動子誘導實驗結果表明,CmbHLH2能與CmMYB6協(xié)同激活CmDFR啟動子。酵母雜交實驗表明,CmbHLH2和CmMYB6均能結合CmDFR啟動子序列,且CmbHLH2可與CmMYB6發(fā)生蛋白互作形成轉錄復合體。瞬時過表達CmbHLH2和CmMYB6能誘導煙草葉片花青苷累積。2、篩選獲得菊花花青苷代謝相關MYB轉錄因子家族成員。利用轉錄組測序,克隆獲得91個在‘Jimba'菊花花瓣中表達的MYBs轉錄因子家族成員。分析了WJ和TRJ中差異表達的MYBs轉錄因子,從中篩選出表達差異倍數大于4的MYBs,其中,CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#39和CmMYB#85在 TRJ 中的表達高于WJ;CmMYB#7和CmMYB#15在TRJ中的表達低于WJ。分析這6個MYBs轉錄因子在TRJ三種不同著色程度花瓣(內層白色花瓣、中層尖紅花瓣、外層全紅花瓣)中的表達模式發(fā)現(xiàn),除CmMYB#39外,CmMYB#17、CmMYB#16 CmMYB#39和CmMYB#85表達與花青苷合成結構基因表達呈正相關。CmMYB#7和CmMYB#15的表達與花青苷合成結構基因表達呈負相關。將這5個轉錄因子作為參與花青苷代謝調控研究的候選MYBs。3、闡明了 R3型MYB抑制子CmMYB#7調控菊花花青苷代謝分子機制。對上述 5 個候選 MYBs CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#85、CmMYB#7 和CmMYB#15進行啟動子誘導效應分析,結果表明,它們均不能單獨激活或抑制花青苷合成結構基因CmDFR和CmUFGT啟動子,當與CmMYB6和CmbHLH2混合時,CmMYB#7可抑制CmMYB6-CmbHLH2復合體對結構基因CmDFR和CmUFGT啟動子的激活效應。酵母雙雜交實驗、定點突變實驗及熒光素酶互補成像實驗結果表明,CmMYB#7通過與CmbHLH2的競爭結合,從而抑制CmMYB6-CmbHLH2復合體對花青苷結構基因的轉錄激活效應。綜上所述,本研究鑒別得到了 1個參與菊花花青苷代謝的bHLH轉錄因子,即CmbHLH2,可與花青苷激活子CmMYB6協(xié)同增強花青苷合成結構基因CmDFR啟動子轉錄活性,進而促進花青苷合成;鑒別獲得了 1個R3型花青苷抑制子CmMYB#7,可與CmMYB6競爭結合CmbHLH2抑制菊花花青苷合成結構基因CmDFR和CmUFGT啟動子轉錄活性,參與TRJ花青苷代謝轉錄調控。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S682.11
【圖文】：

２０１４）進行全長克隆。逡逑進化分析結果表明，與已報道花青苷合成Ｉｌｌｆ亞族ｂＨＬＨｓ聚類到逡逑同一分支（圖２．１Ｂ），ＣｍｂＨＬＨ２與大麗花ＤｖｌＶＳ氨基酸序列相似度為６４％，ＤｖＪＦＳ逡逑已報道參與大麗花花青苷合成（Ｏｈｎｏ等，２０１１）。其與擬南芥ＴＴ８氨基酸序列逡逑相似度達５９％，ＴＴ８能與擬南芥ＭＹＢ轉錄因子ＰＡＰ１結合形成復合體調控花青逡逑苷合成（Ｄｕｂｏｓ等，２０１０）。ＣｍｂＨＬＨｌ則聚類到其他分支。逡逑結構域分析結果表明，ＣｍｂＨＬＨｌ和ＣｍｂＨＬＨ２包含一個螺旋－環(huán)－螺旋結構逡逑１７逡逑

三個品種早小菊‘ｚｒ，邋ｆＺ２’和‘Ｚ３’分別呈深紅色、粉紅色和黃色（圖逡逑２．２Ａ）�；ò昕偦ㄇ嘬蘸窟M行測定結果，Ｚ１’花青苷含量為２．８３邋ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ２’逡逑花青苷含量為０．０８ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ３’中檢測不到花青苷（圖２．２Ｂ）。結果表明，花逡逑青苷含量差異是三個早小菊品種花色差異的原因之一。逡逑２０逡

ｐｌａｎｔ邋ｃａｒｅ在線軟件分析啟動子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)域包含ＭＹＢ結合元逡逑件ＭＢＳ邋（ＭＹＢ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ），及真核生物轉錄起始ＲＮＡ聚合酶結合位點ＴＡＴＡ逡逑盒，另外還包含一些響應光調控的順式作用元件（圖２．４）。逡逑ＴＡＴＡ逡逑邐▲邋■邋▲邋■邋■邐？—逡逑－７６９邋ｂｐ邐－８０邋ｂｐ逡逑圖２．４邋ＣｍＤ／Ｗ啟動子順式作用元件分析逡逑圓形表示ＴＡＴＡ盒，三角形表示ＭＹＢ識別元件，正方形表示ｂＨＬＨ識別元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｏｆ邋ＣｍＤＦＲ逡逑Ｃｉｒｃｌｅ邋ｍｅａｎｓ邋ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，邋ｔｒｉａｎｇｌｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ＭＹＢ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ，邋ｓｑｕａｒｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ｂＨＬＨ逡逑ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑２．２．５邐ＣｍｂＨＬＨ２協(xié)同ＣｍＭＹＢ６結構基因ＯｗＤ／７？啟動子逡逑為進一步研究ＣｗＷｉＺＪ／７和功能，將其分別構建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋００２９逡逑６２－ＳＫ表達載體，將ＯｍＤＦＴ？啟動子構建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋０８００－ＬＵＣ載體，利用雙僁逡逑光素酶實驗體系分析轉錄因子對啟動子是否存在調控作用。將和逡逑單獨或混合注射本氏煙草，結果表明Ｃｗ和逡逑均不能單獨激活或抑制結構基因ＣｗＤＦ／？啟動子。當與花青苷激活子逡逑（Ｌｉｕ等，２０１５邋）混合后，能顯著增強Ｃ／ＷＭ７５６對ＣｗＤＦｉ？啟動子激逡逑活效應

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 葛翠蓮;黃春輝;徐小彪;;果實花青素生物合成研究進展[J];園藝學報;2012年09期

2 戴燦;苗聰秀;盧光t;;基于重疊延伸PCR法的定點突變技術[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2010年03期

3 溫廣宇,朱文學;天然植物色素的提取與開發(fā)應用[J];河南科技大學學報(農學版);2003年02期

本文編號：2803549