【摘要】：由蛋白磷酸酶和蛋白激酶所催化的蛋白質可逆磷酸化是真核生物體內信號轉導的主要機制。蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶(sucrose nonfermenting-1-related protein kinases,SnRK)亞家族2(SnRK2)和亞家族3(SnRK3)是植物特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。SnRK2是植物脫落酸(ABA)信號通路的必要組件和正調控因子,同時也是滲透脅迫應答的主要參與者;SnRK3也被稱作類鈣調磷酸酶B-亞基(calcineurin B-like,CBL)蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK),是植物在逆境脅迫下維持離子平衡的主要調控者。蘋果(Malus domestica)是世界上最重要的果樹樹種之一,而我國蘋果主產區(qū)黃土高原地區(qū)頻繁出現的干旱、鹽漬和凍害等不利因素嚴重限制了其樹體的生長發(fā)育、果實產量及品質形成。因此,研究蘋果的SnRK2和SnRK3基因能夠為了解蘋果的抗逆分子機制和抗逆改良育種提供理論基礎。本研究從蘋果基因組中系統(tǒng)地分離鑒定SnRK2和SnRK3基因家族成員,對其序列特征進行分析,檢測其在非生物逆境處理下的表達模式,從中選出兩個基因MpSnRK2.10和MdCIPK03分別進行遺傳轉化獲得過表達轉基因植物,探究了轉基因植物對非生物逆境的抗/耐性。獲得的主要研究結果如下:1.蘋果SnRK2基因家族的鑒定及表達分析在蘋果基因組中篩選出14條完整的SnRK2核苷酸預測序列,它們能夠編碼12條推定的蛋白序列�；蛉旧w定位和同線性分析結果表明串聯復制和節(jié)段性復制可能促進了蘋果SnRK2基因家族的擴展。以蘋果砧木富平楸子[Malus prunifolia(Willd)Borkh.]的cDNA為模板,經克隆測序,12條完整的蘋果SnRK2編碼序列(MpSnRK2.1—MpSnRK2.12)均被核實。系統(tǒng)發(fā)育分析表明MpSnRK2可以分為4組,各組內成員具有相似的基因結構和保守結構域。MpSnRK2各成員在富平楸子不同組織中的表達模式有所差異。干旱、鹽及ABA處理能夠誘導部分家族成員在葉片中的表達上調,預示著這些基因可能在蘋果對非生物逆境的響應中具有功能。2.過表達MpSnRK2.10增強轉基因植物的抗旱性和耐鹽性將MpSnRK2.10轉化擬南芥和GL-3蘋果產生過表達轉基因植株。在正常培育條件下過表達MpSnRK2.10對植物的生長發(fā)育無影響。在干旱和鹽處理條件下,轉基因植株與野生型植株(WT)相比外觀形態(tài)損傷較輕,脅迫損害相關生理指標改善,表明轉基因植株的抗旱和耐鹽能力更強。此外,轉基因蘋果對由ABA引起的生長抑制更敏感。在ABA、甘露醇和NaCl處理下,脅迫誘導基因MdRAB18、MdRD22和MdRD29B在轉基因蘋果中的表達量高于野生型植株。這些結果說明在逆境條件下,過表達MpSnRK2.10可能通過加強ABA信號輸出從而增強轉基因植株的抗旱性。3.蘋果CIPK(SnRK3)基因家族的鑒定及表達分析在蘋果基因組中篩選出44條完整的CIPK核苷酸預測序列,它們能夠編碼32條推定的蛋白序列(MdCIPK01—MdCIPK32)�；贛dCIPK基因的染色體定位和同線性分析,發(fā)現了10對串聯復制序列和11對旁系同源序列,由此推測串聯復制和節(jié)段性復制事件可能極大地促進了蘋果CIPK基因家族的擴展。以‘金冠’蘋果(Malus domestica cv.Golden Delicious)的cDNA為模板,經克隆測序,19條完整的蘋果CIPK編碼序列得到核實。蛋白序列比對分析顯示所有的MdCIPK都具有高度保守的ATP結合位點、激酶活化環(huán)、NAF及PPI序列元件(Motif)。在系統(tǒng)發(fā)育分析中,12個MdCIPK聚在多內含子類群,20個MdCIPK聚在寡內含子類群,大部分MdCIPK以緊鄰成對的聚集方式分布于各分支中。在干旱、NaCl、ABA及低溫處理下,多數MdCIPK的表達下調,但MdCIPK03的表達顯著上調,預示著該基因可能在蘋果的非生物逆境應答中具有重要作用。4.過表達MdCIPK03增強轉基因擬南芥的抗旱性、耐鹽性和耐寒性將MdCIPK03轉化擬南芥產生過表達轉基因植株。在正常培育條件下過表達MdCIPK03對擬南芥的生長發(fā)育無影響。在干旱、鹽及冷凍處理下,轉基因植株與WT相比外觀形態(tài)損傷較輕,脅迫損害相關生理指標改善,存活率升高,表明轉基因植株對非生物逆境的對抗/耐受能力增強。這些結果預示著MdCIPK03可能對蘋果的非生物逆境應答具有正調控作用。此外,MdCIPK03在酵母雙雜交試驗中能與蘋果MdCBL1、MdCBL3、MdCBL4和MdCBL5互作,說明MdCIPK03的活性及功能可能是由這些鈣結合蛋白調控的。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S661.1
【圖文】：

西北農林科技大學博士學位論文表達量在硝態(tài)氮處理時下調；異源表達 MhSnRK1 的轉基因番茄與野生型對照相比，其葉片和成熟果實中的可溶性糖及淀粉含量升高（Li et al. 2010）。MdSnRK1.1 能夠磷酸化 MdJAZ18（JA 信號通路抑制因子）以促進其由 26S 蛋白酶體介導的降解從而解除其對蘋果堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）類轉錄因子 MdbHLH3 的抑制，由此釋放的 MdbHLH3 則激活相關調控和結構基因的表達并最終促成花青素的生物合成（Liu et al. 2017）。對蘋果 SnRK1 的研究表明了 SnRK1 在 JA 信號中的調控作用并揭示了蔗糖誘導類黃酮物質合成的分子機理。

圖 1-2 SnRK2 的系統(tǒng)發(fā)育分類和結構示意圖（Fujita et al. 2013）Fig. 1-2 Phylogenetic tree and domain structure of SnRK2 protein kinases：來自擬南芥、水稻、卷柏、苔蘚、綠藻和其他維管植物 SnRK2 的激酶結構域及 Domain Ⅰ 用對建樹（鄰接法）。右圖為 SnRK2 的功能區(qū)和結構域示意圖及 ABA 和滲透脅迫對各個 SnRK2 活效應。ote: The kinase domain and the Domain Ⅰ of SnRK2 in Arabidopsis, rice, spikemoss, moss, green algnd other species of vascular plants were used for the alignment to create the neighbor-joinihylogenetic tree. The organization of the functional regions and conserved domains is shown in cartoormat on the right. The activation of each SnRK2 by ABA or osmotic stress is indicated.1.3.2 SnRK2 與 ABA 信號通路1.3.2.1 第三亞類 SnRK2 在 ABA 信號轉導中的功能ABA 作為 種重要的植物激素在調控種子成熟、萌發(fā)、幼苗生長等 系列發(fā)育生理過程及控制多種非生物逆境響應中發(fā)揮關鍵作用（Fujii and Zhu 200Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006）。在早期的 ABA 信號通路研究中，研究者

圖 1-3ABA 信號通路模式及核心元件的演化（Komatsu et al. 2013; Umezawa et al. 2010）Fig. 1-3 Evolutionary model of ABA signaling and the core components注：（A）小立碗蘚（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）和擬南芥中 ABA信號通路核心組件的數目分別代表了其在苔蘚植物、蕨類植物及被子植物中的數目。（B）苔蘚植物的祖先（中）以依賴 ABA 的方式通過募集 PP2C 來調控先前存在的營養(yǎng)體脫水耐受（desiccatiotolerance，DT）信號通路（左），但 PP2C 位于 SnRK2 的下游發(fā)揮功能。在種子植物的祖先（右）中，SnRK2 則由 PP2C 嚴格監(jiān)管，此種演變或許有益于對 SnRK2 日益增多的下游靶標的綜合調控Note: (A) As representatives, component numbers of bryophyte, lycophyte and angiosperm were obtaifrom Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffii and Arabidopsis thaliana, respectively. (B) ancestor of bryophytes (middle) recruited PP2C which action downstream of SnRK2 to control pre-existing pathway for vegetative desiccation tolerance (DT) (left) in an ABA-dependent manner. ancestor of seed plants (right) developed tight regulation of SnRK2 by PP2C, which enabled integrregulation of an increased number of signalling pathways downstream of SnRK2.

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陳學森;韓明玉;蘇桂林;劉鳳之;過國南;姜遠茂;毛志泉;彭福田;束懷瑞;;當今世界蘋果產業(yè)發(fā)展趨勢及我國蘋果產業(yè)優(yōu)質高效發(fā)展意見[J];果樹學報;2010年04期

相關博士學位論文 前5條

1 謝銀鵬;蘋果MdMYB88和MdMYB124轉錄因子在低溫和干旱脅迫中的作用機理研究[D];西北農林科技大學;2018年

2 王娜;蘋果YTH結構域RNA結合蛋白基因MhYTP1和MhYTP2的功能研究[D];西北農林科技大學;2017年

3 李超;外源褪黑素和多巴胺對蘋果抗旱耐鹽性的調控功能研究[D];西北農林科技大學;2016年

4 王平;外源褪黑素對蘋果葉片衰老的調控及相關自噬基因的功能分析[D];西北農林科技大學;2015年

5 馬小衛(wèi);蘋果屬植物種間水分利用效率的差異及其機理研究[D];西北農林科技大學;2009年

本文編號：2801145