【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的蔬菜之一,在我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)中同樣重要。在基礎(chǔ)研究方面,番茄和擬南芥均是重要的模式植物。利用番茄和擬南芥研究植物開(kāi)花以及根的發(fā)育調(diào)控機(jī)制能幫助我們深入認(rèn)識(shí)植物的發(fā)育,同時(shí)為農(nóng)作物的遺傳改良提供重要的理論基礎(chǔ)。在本研究前期工作中發(fā)現(xiàn),超表達(dá)番茄C2H2型鋅指蛋白Sl ZF3可以提高植物的耐鹽性,該鋅指蛋白C端含有EAR-motif,具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。同時(shí),我們還觀察到Sl ZF3超表達(dá)番茄和擬南芥在發(fā)育方面也發(fā)生了明顯的變化,如矮化、葉片與莖稈之間夾角變小、開(kāi)花延遲等。在本研究中,我們針對(duì)Sl ZF3調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的分子機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究。此外,我們將Sl ZF3異位超表達(dá)到擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短根突變體folb2,通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該突變體非T-DNA插入導(dǎo)致,而是自然突變。通過(guò)圖位克隆發(fā)現(xiàn),突變體中At Fol B2的啟動(dòng)子和5`UTR區(qū)缺失了61bp,造成At Fol B2轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,并導(dǎo)致根的發(fā)育缺陷。At Fol B2編碼二氫新碟呤醛縮酶,位于葉酸合成途徑上游。在本研究中,我們較為深入的研究了At Fol B2如何調(diào)控植物主根和不定根的發(fā)育。主要研究結(jié)果如下:1.在番茄和擬南芥中超表達(dá)Sl ZF3可以顯著延遲開(kāi)花時(shí)間,而RNA干涉Sl ZF3能夠使番茄提早開(kāi)花。同時(shí),在擬南芥中超表達(dá)Sl ZF3的直系同源基因ZAT12也可以顯著延遲開(kāi)花時(shí)間,而RNA干涉ZAT12能夠顯著促進(jìn)擬南芥開(kāi)花。2.通過(guò)酵母雙雜交和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)Sl ZF3與At CO直接互作。CoIP實(shí)驗(yàn)表明Sl ZF3與At CO在番茄中的同源蛋白Sl CO1直接互作,并且其EAR-motif對(duì)互作不是必須的。另外,遺傳學(xué)證據(jù)也證明Sl ZF3與At CO是互作的。3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明,SlZF3可顯著抑制AtFT啟動(dòng)子的活性,而At CO則可顯著提高At FT啟動(dòng)子活性。Ch IP-q PCR實(shí)驗(yàn)表明,Sl ZF3或ZAT12可以結(jié)合在At FT啟動(dòng)子靠近5`UTR的區(qū)域。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Sl ZF3和ZAT12可以分別結(jié)合到SFT和At FT啟動(dòng)子上的5’UTR Py-rich stretch和TCA順式元件,但和單獨(dú)一個(gè)順式元件5’UTR Py-rich stretch或者TCA都不能結(jié)合。上述兩個(gè)元件與At CO蛋白在擬南芥At FT啟動(dòng)子上的結(jié)合元件CORE2相鄰,與番茄SFT啟動(dòng)子上的CORE2順式元件距離76 bp。4.綜合結(jié)果表明,Sl ZF3通過(guò)直接與CO互作以及結(jié)合到FT啟動(dòng)子上的兩個(gè)順式元件5`UTR Py-rich stretch和TCA而負(fù)調(diào)控植物開(kāi)花。5.在ZF3異位表達(dá)的擬南芥株系中偶然發(fā)現(xiàn)的一個(gè)根系突變體folb2,該突變體主根生長(zhǎng)受抑制,在莖基處產(chǎn)生1-2個(gè)不定根。PI以及I2-IK染色發(fā)現(xiàn)folb2突變體根尖分生區(qū)不完整。圖位克隆發(fā)現(xiàn)At Fol B2啟動(dòng)子和5`UTR過(guò)渡區(qū)缺失了61 bp,該缺失造成At Fol B2轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。創(chuàng)建了folb2的功能互補(bǔ)材料(FC)和野生型背景的RNAi材料,發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)材料中根系表型得到恢復(fù),而RNAi材料的根系表型與folb2類似。同時(shí)也創(chuàng)建了At Fol B2在番茄中的同源基因Sl Fol B2的RNAi材料,其根系表型與folb2類似。6.LC-MS測(cè)定葉酸發(fā)現(xiàn),四氫葉酸THF及其衍生物5-M-THF或者四氫葉酸前體DHF,在folb2突變體和RNAi材料中顯著下降,而在互補(bǔ)系中含量恢復(fù)至野生型水平。在培養(yǎng)基中外源施加5-F-THF可以恢復(fù)folb2突變體的表型。在番茄Sl Fol B2 RNAi株系中,四氫葉酸THF及其衍生物(5-M-THF和5-FTHF)或者四氫葉酸前體DHF均顯著下降。7.探討了At Fol B2突變對(duì)生長(zhǎng)素分布和信號(hào)響應(yīng)途徑的影響。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)素運(yùn)輸和信號(hào)響應(yīng)基因顯著下調(diào),而生長(zhǎng)素響應(yīng)下游基因LBD41顯著上調(diào)表達(dá),q RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。LC-MS測(cè)定Col-0、folb2和FC中葉片和根中生長(zhǎng)素含量發(fā)現(xiàn),盡管突變體folb2中的生長(zhǎng)素含量降低了,但是功能互補(bǔ)系中的生長(zhǎng)素水平和folb2相比無(wú)顯著差異,因此生長(zhǎng)素含量的變化不是folb2突變體表型缺陷的主要原因。利用報(bào)告系DR5:m GFP、PINs:GFP、WOX5:GFP以及DII:VENUS:YFP進(jìn)行雜交調(diào)查報(bào)告基因表達(dá),結(jié)果表明葉酸可以調(diào)控生長(zhǎng)素向根尖極性運(yùn)輸以及生長(zhǎng)素在根成熟區(qū)維管束和周圍組織中的分布。8.遺傳學(xué)證據(jù)表明,LBD41是At Fol B2的一個(gè)下游靶基因。在folb2突變體中干涉LBD41后,folb2突變體根缺陷表型恢復(fù)至野生型狀態(tài)。綜合研究表明,葉酸通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸以及分布對(duì)根尖分生區(qū)的保持起著關(guān)鍵作用。它主要通過(guò)LBD41調(diào)控植物主根和不定根的發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S641.2
【圖文】：

在菊花中有一個(gè) B-BOX 型鋅指蛋白 CmBBX24，干涉 CmBBX24 可以是超表達(dá)株系開(kāi)花時(shí)間沒(méi)有明顯變化(Yang and Gao 2014)。番茄中，超表達(dá) C2H2 類鋅指蛋白 SlZFP2 可以促進(jìn)番茄開(kāi)花，進(jìn)一SlZFP2 可以結(jié)合到 SFT 啟動(dòng)子上并激活 SFT 的表達(dá)，但是 RNA 干涉 間沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明 SlZFP2 不是關(guān)鍵的番茄開(kāi)花調(diào)控因子(Wen。在我們之前的研究中，利用對(duì)鹽處理番茄材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)理響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其中一個(gè)為 SlZF3 (GenBank accession no. DY523accession no. Solyc06g075780) (Ouyang et al., 2007)。C2H2 型鋅指蛋白系同源的 ZAT12 可以通過(guò)與 CSN5B 互作提高番茄和擬南芥的耐鹽性超表達(dá) SlZF3/ZAT12 對(duì)番茄和擬南芥發(fā)育方面也產(chǎn)生顯著影響，包括，但是具體的分子機(jī)制還不清楚(Li et al 2017a)。

圖 1.2 C2H2 型鋅指蛋白 SlZF3 負(fù)調(diào)控番茄和擬南芥開(kāi)花時(shí)間。a, 野生型 Alisa Craig、SlZF3 超量表達(dá)（OE-8 和 OE-37）和 RNAi 株系（RNAi-6 和 RNAi-30）開(kāi)花表型（3 個(gè)月苗齡）；b, 番茄各株系前三個(gè)花序的開(kāi)花時(shí)間；c, e, 野生型擬南芥 Col-0、

圖 1.3. ZAT12 超表達(dá)材料的 RNA-seq 分析以及 SlZF3在花器官中的表達(dá)。a, b, ZAT12 超表達(dá)材料 OX-10 和 OX-3 與野生型 Col-0 之間的差異表達(dá)基因數(shù)，每個(gè)樣品 2個(gè)生物學(xué)重復(fù)；c, d, AtFT在 OX-10 和 OX-3 系中下調(diào)表達(dá)。e, qRT-PCR 分析 Col-0, OX-10 和

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本文編號(hào)：2798697