【摘要】：蠟梅(Chimonanthus praecox L.)為蠟梅科蠟梅屬植物,以“耐寒、耐旱、耐剪”而著稱,花期12月至翌年2月,傲雪屹立,凌寒怒放�；ㄊ侵参矬w對抗外界逆境最弱的部分,但是蠟梅花卻盛開在嚴(yán)寒的冬季,推測蠟梅在抵御外界低溫的調(diào)控路徑中,可能存在一些功能比較特別的調(diào)控因子,目前,低溫信號途徑研究得比較清楚的是CBF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。CBF/DREB1基因位于CBF途徑的中心位置,調(diào)控表達(dá)受到各種信號因子的影響,在低溫應(yīng)答途徑中起到“總開關(guān)”的作用,ICE1基因是CBF的上游調(diào)控因子,可以通過結(jié)合CBF的啟動子區(qū)調(diào)控下游基因的表達(dá),目前蠟梅抗寒性的研究主要集中在功能基因上,基于ICE1和CBF/DREB1基因在植物應(yīng)答低溫路徑上的重要作用,因此這兩類轉(zhuǎn)錄因子的研究對了解蠟梅的抗寒機(jī)制有重要的意義�；诒緦嶒炇抑鞍l(fā)現(xiàn)的2個ICE類的轉(zhuǎn)錄因子CpICE11和CpICE12,本實驗的主要內(nèi)容是克隆具有完整結(jié)構(gòu)域的CpICE1a、CpICE1b基因和1個DREB1類基因—CpDREB1基因,并分析其功能,一方面運(yùn)用實時定量技術(shù)分析CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在蠟梅各個器官、花發(fā)育的不同階段和低溫條件下的表達(dá)量變化,然后構(gòu)建表達(dá)載體,運(yùn)用轉(zhuǎn)基因的手段將這三個基因轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行功能探究,另一方面克隆CpDREB1的啟動子序列,為之后研究CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1的互作做基礎(chǔ),主要結(jié)果如下:(1)克隆CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1的開放閱讀框,得到了CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在gDNA中全長,對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CpDREB1無內(nèi)含子,CpICE1a和CpICE1b基因包含2個內(nèi)含子、3個外顯子,在結(jié)構(gòu)上,與擬南芥、蘋果、梅花、葡萄中ICE1類基因的3個內(nèi)含子、4個外顯子不同,具有本物種的特殊性。(2)克隆得到CpDREB1的啟動子序列431bp,其中存在一個MYC結(jié)合位點和多個脅迫誘導(dǎo)調(diào)控作用位點,如:響應(yīng)茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)和水楊酸(SA)的作用元件。(3)利用qPCR技術(shù),檢測分析CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1轉(zhuǎn)錄因子在蠟梅不同部位、花發(fā)育的不同階段和低溫條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明,CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1在蠟梅的莖、葉、花、果及花發(fā)育的不同階段都有不同程度的表達(dá),這三個基因都能響應(yīng)低溫脅迫,但是兩類基因的表達(dá)模式不同,推測在蠟梅開花階段為適應(yīng)低溫環(huán)境,維持自身生長,可能存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。(4)構(gòu)建CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入煙草中,分別得到轉(zhuǎn)基因煙草47株、47株和44株,在低溫處理探究基因功能方面,對長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行4度處理24h后,野生型失水萎蔫程度比轉(zhuǎn)基因植株的嚴(yán)重,4℃處理3h后,部分轉(zhuǎn)基因單株處理前后MDA含量的變化幅度比野生型小,其轉(zhuǎn)入的目的基因的表達(dá)量也高于其他單株,抗寒能力得到提高,通過半定量分析,在自然生長條件下,轉(zhuǎn)CpICE1a和CpICE1b基因可以促進(jìn)煙草中NtLEA5基因的表達(dá),而同樣為LEA類基因的NtERD10D的表達(dá)幾乎不變,而在轉(zhuǎn)CpDREB1的煙草中,即使CpDREB1的表達(dá)量很高,但是這兩個基因的表達(dá)沒有明顯的變化,說明CpICE1a和CpICE1b的導(dǎo)入,在正常生長條件下就可以提高煙草對逆境的抵抗能力,而CpDREB1在正常生長條件下,可能不影響這兩個抗逆基因的表達(dá)。低溫處理后,在轉(zhuǎn)CpICE1a的煙草中,CpICE1a和NtERD10D的表達(dá)量升高,而在CpDREB1的轉(zhuǎn)基因煙草中,低溫不影響CpDREB1和NtERD10D的表達(dá),說明在轉(zhuǎn)基因煙草中,低溫可以誘導(dǎo)CpICE1a的表達(dá),并且影響其對下游功能基因的調(diào)控,而CpDREB1不受低溫誘導(dǎo),而且NtERD10D可能不是CpDREB1在煙草中的下游靶基因,在冷脅迫的情況下,無論在野生型還是CpICE1a和CpDREB1的轉(zhuǎn)基因植株中,NtLEA5的表達(dá)都明顯升高,半定量的結(jié)果,顯示不出與野生型的區(qū)別,無法確定轉(zhuǎn)基因?qū)tLEA5的影響,需要后續(xù)的實驗驗證。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S685.99
【圖文】：

1 植物激素通過調(diào)控 CBF 參與低溫脅迫（Barrero-Gil and Salina1 Current model of CBF Regulation by Phytohormones during Cold5) 植物開花誘導(dǎo)與 CBF：在適當(dāng)?shù)臅r間開花是植物繁育后代的重是由內(nèi)源信號和環(huán)境因素組成的復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，擬南芥因 SOC1（Suppressor of Overexpression of Constans1）編碼 MADS與多個開花誘導(dǎo)途徑，對擬南芥突變體的微陣列分析和后期試驗基因 SOC1 在低溫響應(yīng)過程中，可以直接作用于 CBFs，對該類基。FLC（Flowering Locus C）是位于 SOC1 上游的一個負(fù)調(diào)控因子花決定調(diào)節(jié)基因之間的反循環(huán)模型中起重要作用，如圖 2 所示：外界溫度低，低溫信號促進(jìn)了 CBFs 的表達(dá)，一方面提高了植物力，一方面促進(jìn)了 FLC 的表達(dá)，推遲了開花時間，F(xiàn)LC 的表達(dá)量C1 的表達(dá)，進(jìn)而解除了 SOC1 對 CBFs 的抑制作用，CBFs 的表達(dá)得后期，外界溫度升高，植物通過 SOC1 的表達(dá)抑制 CBFs 的表達(dá)誘導(dǎo)植物開花（Seo et al 2009）。

物激素通過調(diào)控 CBF 參與低溫脅迫（Barrero-Gil and Srrent model of CBF Regulation by Phytohormones during物開花誘導(dǎo)與 CBF：在適當(dāng)?shù)臅r間開花是植物繁育后代內(nèi)源信號和環(huán)境因素組成的復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，擬SOC1（Suppressor of Overexpression of Constans1）編碼 M個開花誘導(dǎo)途徑，對擬南芥突變體的微陣列分析和后期 SOC1 在低溫響應(yīng)過程中，可以直接作用于 CBFs，對該LC（Flowering Locus C）是位于 SOC1 上游的一個負(fù)調(diào)控定調(diào)節(jié)基因之間的反循環(huán)模型中起重要作用，如圖 2 所溫度低，低溫信號促進(jìn)了 CBFs 的表達(dá)，一方面提高了一方面促進(jìn)了 FLC 的表達(dá)，推遲了開花時間，F(xiàn)LC 的表表達(dá)，進(jìn)而解除了 SOC1 對 CBFs 的抑制作用，CBFs 的表，外界溫度升高，植物通過 SOC1 的表達(dá)抑制 CBFs 的植物開花（Seo et al 2009）。

蛋白的活性繼而調(diào)控 CBF 的表達(dá)，因此可以推測低溫可以使植物產(chǎn)生一些類似 P信號分子，這些信號分子一方面可能通過與 SIZ1 結(jié)合，影響 SIZ1 的活性，SUM化 ICE1 蛋白，ICE1 的 SUMO 化可以抑制 HOS1 介導(dǎo)的 ICE1 的泛素化，增強(qiáng)了 IC蛋白的穩(wěn)定性。另一方面信號分子參與到 ABA 信號途徑，與 ABI1 結(jié)合，解除 AB對于 OST1 活性的抑制，激活后的 OST1 可以磷酸化 ICE1，激活其轉(zhuǎn)錄活性，然ICE1 蛋白結(jié)合到 CBF 啟動子上的 MYC 結(jié)合作用位點上，促進(jìn) CBFs 的表達(dá)，接來CBFs又可以與下游功能基因啟動子上的CRT/DRE元件結(jié)合啟動功能基因的表增加植物對冷凍脅迫的抵抗能力。OST1 還可以與 HOS1 互作，抑制 ICE1 和 HO的相互作用，增強(qiáng) ICE1 蛋白的穩(wěn)定性，低溫調(diào)控是一個精細(xì)的調(diào)控方式，ICE1 速的激活是由于 SIZ1 介導(dǎo)的 SUMO 化，隨后 ICE1 的失活是由于 HOS1 介導(dǎo)的泛化和降解。低溫誘導(dǎo) CBF 轉(zhuǎn)錄水平快速、明顯的增加，在 2-3h 達(dá)到最大值，隨降低到和常溫下植物 CBF 轉(zhuǎn)錄水平幾乎相當(dāng)。SIZ1—HOS1 系統(tǒng)有助于上調(diào)低溫導(dǎo)基因表達(dá)的同時阻止了潛在有害作用下的失控誘導(dǎo)（霍晨敏和湯文強(qiáng) 2016Agarwal et al 2017）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2790110