【摘要】：生長(zhǎng)素參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多階段,是十分重要的植物激素。同時(shí),ARF家族對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)進(jìn)行調(diào)控,是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子。迄今為止,擬南芥、葡萄、番木瓜、蘋果等許多物種ARF家族生物信息學(xué)的研究相繼被報(bào)道,但關(guān)于草莓ARF家族鮮有報(bào)道。本研究對(duì)草莓ARF基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)鑒定并構(gòu)建了MIR167及ARF6過表達(dá)載體,ARF6干擾載體,獲得了轉(zhuǎn)基因草莓植株,通過轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察揭示出草莓MIR167、ARF6基因的功能。主要結(jié)果如下:(1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得12個(gè)草莓ARF家族基因(FvARFs),分別是FvARF1、FvARF2、FvARF3、FvARF4、FvARF5、FvARF6、FvARF8、FvARF9、FvARF17、FvARF18、FvARF19和FvARF23。對(duì)家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,12個(gè)基因在進(jìn)化樹中被分為四個(gè)分支,FvARF6與AtARF6、FvARF3與MdARF3、FvARF23與MdARF23、FvARF1與MdARF1等為同一分支的姐妹基因?qū)?進(jìn)化關(guān)系較近。FvARFs不平均的分布在五條染色體上,FvARFs都含有三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,只有FvARF3、FvARF17、FvARF18是截?cái)嗟腃TD結(jié)構(gòu)域。家族基因外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)不同,內(nèi)含子的數(shù)量從1-16不等。利用MEME數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,除FvARF17之外,家族基因保守基序分布及結(jié)構(gòu)相似。(2)以‘艷麗’草莓為試材,采用qRT-PCR的方法對(duì)其不同器官、不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn):FvARFs在所有器官中均有表達(dá);在不同的果實(shí)發(fā)育階段FvARFs的相對(duì)表達(dá)量均是隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量逐漸降低。(3)對(duì)‘Ruegen’草莓試管苗采用10μmol·L~(-1)的IAA分別處理0 h,6 h,12 h,24 h,48 h和不同IAA濃度(0μmol·L~(-1),0.1μmol·L~(-1),1μmol·L~(-1),10μmol·L~(-1),25μmol·L~(-1))處理12 h。qRT-PCR結(jié)果顯示,10μmol·L~(-1)IAA處理12 h時(shí)ARF家族基因表達(dá)量最高。(4)利用RT-PCR的方法從‘艷麗’草莓中克隆出MIR167及靶基因ARF6,獲得ARF6基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)2646 bp,編碼882個(gè)氨基酸,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中二倍體ARF6序列相似度高達(dá)98.68%,克隆出的MIR167基因長(zhǎng)度為305 bp。(5)構(gòu)建了ARF6突變基因的過表達(dá)載體、MIR167基因過表達(dá)載體、ARF6干擾載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入‘Ruegen’草莓苗中。得到MIR167過表達(dá)植株4個(gè)株系和ARF6干擾植株3個(gè)株系。表型觀察發(fā)現(xiàn)MIR167過表達(dá)植株和ARF6干擾植株都表現(xiàn)出分枝數(shù)和根系數(shù)量的增加,ARF6干擾植株葉片深綠狹長(zhǎng)并呈現(xiàn)出向內(nèi)卷曲皺縮的現(xiàn)象。(6)構(gòu)建了pGBKT7-ARF6融合載體并與pGBKT7空載體同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母菌感受態(tài),通過一缺、三缺培養(yǎng)基的長(zhǎng)勢(shì)分析,鑒定出ARF6為轉(zhuǎn)錄激活因子。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S668.4
【圖文】：

2.3 結(jié)果與分析2.3.1 草莓 ARF 基因家族的鑒定及染色體分布分析在草莓中共鑒定出 12 個(gè) ARF 基因（表 2），這些基因的名稱遵照 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的名稱。12 個(gè) FvARF 的分析結(jié)果，預(yù)測(cè)的蛋白長(zhǎng)度在 510（FvARF17）到 1161（FvARF19）的范圍內(nèi)不等，ORF長(zhǎng)度范圍從1579 b（pFvARF17）到4703 b（pFvARF19）之間，CDS 序列的大小在 1530 bp（FvARF17）至 3933 bp（FvARF5）之間。此外，F(xiàn)vARF的理論等電點(diǎn)（PI）和分子量分別為5.25至8.29和10.065 kDa至130.113 kDa。結(jié)果與前人的結(jié)果一致（Die et al., 2018），表明這些 FvARF 在不同的亞細(xì)胞環(huán)境中起作用。為了進(jìn)一步了解 FvARFs 在染色體上的分布，12 個(gè) FvARFs 被定位在五條染色體上（圖 1）。根據(jù)草莓 ARF 基因分布的特性，12 個(gè) FvARFs 分布在 7 條染色體中的 5條，并且 FvARFs 呈現(xiàn)出了不均勻分布。其中，LG5 和 LG2 兩條染色體上各含有三個(gè) ARF 基因。LG1，LG4 和 LG3 的每個(gè)染色體含有兩個(gè) ARF 基因。

和 FvARF18 兩個(gè)成員；第二組中，草莓家族只有個(gè)草莓家族基因，分別是最多，草莓中含有六個(gè)，即。同一染色體上的的不規(guī)則。該結(jié)果與鷹嘴豆研究的結(jié)果一致（們發(fā)現(xiàn) 9 個(gè) FvARFs前人的研究我們將處于進(jìn)化樹的同一分支中的兩個(gè)基因命名為姐妹基al., 2015），包括，F(xiàn)vARF1 和 MdARF1F8，F(xiàn)vARF6 和 AtARF6姐妹基因?qū)?shù)量最多，這與蘋果和草莓同屬薔薇科的原因密切相關(guān)。在們將其中一個(gè)小分支命名為他物種都沒有發(fā)現(xiàn)與之高度相似的基因，意味著這些能長(zhǎng)期演變獲得的（FvARF3FvARF2，F(xiàn)vARF4 和 FvARF23；第四組含有最多，草莓中含有六個(gè)，即 FvARF1，F(xiàn)vARF5，F(xiàn)vARF6，F(xiàn)vARF8FvARF 蛋白屬于不同的亞群，說明了Die et al., 2018與進(jìn)化樹中的其他物種的 ARF 家族成員有相對(duì)密FvARF17 和 CpARF17，F(xiàn)vARF3 和 MdARF3，F(xiàn)vARF4 和 AtARF4，F(xiàn)vARF5 和 MdARF5。然而，我們發(fā)現(xiàn)草莓之間中沒有姐妹基因?qū)Ia，這里 9 個(gè)擬南芥 ARF 基因?qū)儆谝粋�(gè)獨(dú)AtARFLuo et al., 2014; Ha et al., 2013）（圖 2一個(gè)成員；；第四組含有，F(xiàn)vA白屬于不同的亞群，說明了 FvARFs 的分）。在所有，F(xiàn)vAR，F(xiàn)是通過擬）。

第二章草莓生長(zhǎng)素響應(yīng)因子家族全基因組鑒定及表達(dá)分析.3.3 ARF 基因家族結(jié)構(gòu)分析典型的 ARF 具有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是位于 N 末端區(qū)域的 B3 DNA 結(jié)合結(jié)域（DBD）、位于 C 末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD）和位于二者之間的行使激活或抑制能的中間結(jié)構(gòu)域（MR）（Xing et al., 2011）。通過 PROSITE 和 PLAZA 在線軟件檢索和分析草莓的 ARF 蛋白質(zhì)序列，圖 3顯示了 12 個(gè) FvARF 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的位置分布。所有 FvARF 均包含 B3-DNA 結(jié)合構(gòu)域（DBD）和中間結(jié)構(gòu)域（MR）。除了 ARF3，ARF17 和 ARF18 之外，F(xiàn)vARF列均含有 C 末端的 CTD 結(jié)構(gòu)域。通過對(duì) FvARFs 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，同一進(jìn)化分枝中總是具有相似的結(jié)構(gòu)，但是有些基因在同一分組中含有不同的基因結(jié)構(gòu)。其，三個(gè) FvARFs（FvARF3，F(xiàn)vARF17 和 FvARF18）具有截短的 CTD 結(jié)構(gòu)域，它分布在進(jìn)化樹的組 I 和組 II 中。到目前為止，草莓中尚未發(fā)現(xiàn)僅包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域的vARF 基因（圖 3）。

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