【摘要】：葡萄風(fēng)信子(Muscari spp.)是一種重要的觀賞球根花卉。因其獨特的藍(lán)色色調(diào)和花型,被用于花園地被和家庭盆栽種植,也為研究藍(lán)色花呈色機(jī)理提供了理想材料。葡萄風(fēng)信子的花色形成主要依賴于類黃酮物質(zhì),特別是藍(lán)色花青素衍生物。課題組前期研究推斷葡萄風(fēng)信子的二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)和黃酮醇合酶(FLS)基因可能通過調(diào)控花青素合成途徑代謝通量共同調(diào)控藍(lán)色花形成。本研究以藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘黑眼睛’(M.aucheri‘Dark Eyes’)為材料,對DFR和FLS基因調(diào)控葡萄風(fēng)信子藍(lán)色花形成機(jī)理進(jìn)行研究,主要取得以下結(jié)果:(1)克隆得到兩個DFR基因,分別命名為MaDFR(MK937098)和MaDFR1(KJ619964)�；蚓幋a區(qū)全長均為1101 bp,編碼366個氨基酸,蛋白質(zhì)的分子量分別約為40.93 KDa和41.00 KDa;經(jīng)氨基酸序列比對,兩個蛋白同源性為97.27%。其中,MaDFR1和葡萄風(fēng)信子‘白麗人’DFR序列同源性為100%。通過和其它物種已知功能的DFR蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),MaDFR和MaDFR1均具有保守的NADPH結(jié)合區(qū)域和底物特異性結(jié)合區(qū)域。聚類分析表明它們屬于單子葉NADPH依賴性短鏈還原酶的二氫黃酮醇-4-還原酶家族。MaDFR和MaDFR1均定位于細(xì)胞質(zhì)中,其轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有組織特異性,尤其是在花中高表達(dá),與飛燕草素的積累正相關(guān)。(2)體外原核表達(dá)及酶活分析表明,MaDFR和MaDFR1均具有催化二氫山奈酚(DHK)、二氫槲皮素(DHQ)和二氫楊梅素(DHM)生成相應(yīng)無色花青苷的能力,并且,優(yōu)先催化DHM生成無色的飛燕草素。此外,氨基酸點突變試驗證實了底物結(jié)合特異區(qū)域中第135位的天門冬酰胺(N)和第146位的谷氨酸(E)決定著MaDFR和MaDFR1酶的底物催化活性。(3)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法在模式植物煙草(Nicotiana tabacum‘NC89’)中過表達(dá)MaDFR(OE-MaDFR)和MaDFR1(OE-MaDFR1)。OE-MaDFR和OE-MaDFR1煙草花冠變成深紅色。高效液相色譜(HPLC)方法定量分析,表明轉(zhuǎn)基因植株中總花青苷的含量相對對照顯著增加。此外,UPLC-Triple-TOF/MS質(zhì)譜分析表明轉(zhuǎn)基因植株中和對照株系中花青苷的種類相同,主要為矢車菊-3-蕓香糖苷(Cy3R),無新物質(zhì)生成。實時定量qPCR分析表明,OE-MaDFR1煙草花冠中,類黃酮3'5'羥化酶(F3'5'H)基因表達(dá)量較低,類黃酮生物合成途徑的其它基因都上調(diào)表達(dá),而OE-MaDFR煙草花冠中,上游結(jié)構(gòu)基因查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因下調(diào)表達(dá),這可能是受植物體內(nèi)類黃酮途徑的反饋機(jī)制影響。煙草中F3'5'H基因在轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系中維持較低本底水平,這可能也是在轉(zhuǎn)基因株系中未能檢測到飛燕草素(Dp)的原因之一。(4)利用染色體步移法克隆得到DFR基因上游調(diào)控序列,大小為1518 bp,順式作用元件分析結(jié)果表明,該啟動子含有重要的CAAT-box、TATA-box,花色相關(guān)的光響應(yīng)元件、以及MYB和MYC類型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。構(gòu)建DFR啟動子全長及不同缺失融合的GUS報告基因載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株并穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化煙草,進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析和GUS轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。結(jié)果表明,DFR基因啟動子只在煙草花冠中表達(dá),且缺失-231 bp--407 bp后,GUS酶活活性顯著減弱。雙熒光素酶試驗分析表明,轉(zhuǎn)錄因子MaMYBA與MaDFR啟動子的-231 bp--407 bp區(qū)域結(jié)合。(5)采用RACE克隆技術(shù)獲得MaFLS基因cDNA序列(MH636605),全長為1418bp。MaFLS基因編碼區(qū)為993 bp,編碼330個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量約為36.45 kDa。氨基酸序列比對和聚類分析表明,MaFLS具有保守的亞鐵結(jié)合位點(His 216,Asp 218和His 272)和2-氧代戊二酸結(jié)合位點(Arg 282和Ser 284),屬于可溶性Fe2+/2-ODD蛋白家族。此外,MaFLS具有潛在催化DHQ活性的高度保守結(jié)合位點,即五個關(guān)鍵氨基酸位點(Tyr 127,Phe 129,Lys 197,Phe 288,Ser 290),它還具有FLS特異性基序“PxxxIRxxxEQP”和“SxxTxLVP”。MaFLS轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有組織特異性,在花發(fā)育的S1(剛形成花蕾期)和S2(花蕾剛開始著色)階段表達(dá),但是其表達(dá)與葡萄風(fēng)信子中總黃酮醇的積累無關(guān)。(6)與野生型煙草粉色花相比,OE-MaFLS煙草株系花冠表現(xiàn)出不同程度的顏色變化:淡粉色至幾乎白色、淺粉色和粉色。對比野生型株系,MaFLS轉(zhuǎn)基因煙草花冠中花青苷的含量顯著降低,而總黃酮醇的積累顯著增加。qPCR分析表明,轉(zhuǎn)基因煙草株系中的NtCHS,黃烷酮3羥化酶(NtF3H),NtDFR,花青素合成酶(NtANS)和煙草R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子(NtAN2)表達(dá)顯著降低,NtFLS基因明顯上調(diào)表達(dá)。綜上所述,MaDFR通過優(yōu)先催化二氫楊梅素導(dǎo)致代謝通量流向藍(lán)色飛燕草素的生成;MaFLS通過與MaDFR競爭共同底物二氫黃酮醇生成黃酮醇類輔色物質(zhì)。二者共同調(diào)控葡萄風(fēng)信子的藍(lán)色花發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S682.29
【圖文】：

圖 1-1 苯丙烷途徑的類黃酮生物合成分支的示意圖(Nielsen et al. 2002)Figure 1-1. Diagrammatic representation of part of the flavonoid biosynthetic branch of thephenylpropanoid pathway (Nielsen et al. 2002).1.3 花青苷和黃酮醇與花色的關(guān)系在類黃酮化合物中，花青苷是花青素前體的糖基化形式，是類黃酮化合物的一種，該亞組包括至少 400 個分子，顏色從橙紅色到紫色不等，取決于 pH 值，共色素沉著，可用的金屬陽離子和骨架的修飾 (Hichri et al. 2011)。最主要的花青素有六大類：飛燕草素、天竺葵素、矢車菊素、芍藥色素、錦葵素和矮牽牛素 (Tanaka and Ohmiya 2008)。從而導(dǎo)致自然界中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物的多樣性和豐富的顏色如紫色，藍(lán)色，橙色和紅色色素沉著。此外，各種花色圖案，例如斑點，雜色，條紋，花邊和漸變，是由不同的花青素積累模式引起的。花青苷基本結(jié)構(gòu)單元 B 環(huán)上的羥基數(shù)有助于植物顏色，羥基越多，顏色越藍(lán)。藍(lán)色/紫色花朵通常包含基于飛燕草素的花青苷，洋紅色/紅色花朵主要包含基于矢車菊素的花色苷，橙/磚紅色花中含有基于天竺葵素的花色苷

圖 1-2 二氫黃酮醇 4-還原酶催化底物的化學(xué)反應(yīng)示意圖Figure 1-2. A schematic diagram showing the chemical reaction catalyzed by dihydroflavono4-reductase..5.3 黃酮醇合酶 (FLS) 基因與花色形成花色是觀賞植物的價值體現(xiàn)，花青素有助于植物呈現(xiàn)豐富多彩的顏色，輔色素和其它類黃酮一起影響花色的色調(diào)和深淺，并且可以穩(wěn)定色素沉著并使花色藍(lán)avies et al. 2003; Nielsen et al. 2002)。黃酮醇是一組黃酮類化合物，可以作為花青輔色素導(dǎo)致花色遷移和花色變化 (Nielsen et al. 2002)。而且，黃酮醇本身可賦予黃者黃色著色 (Zhou et al. 2013)�；ㄇ嗨睾忘S酮醇均由類黃酮途徑的分支產(chǎn)生，并衍生自二氫黃酮醇 (二氫山萘HK，二氫槲皮素：DHQ 和二氫楊梅素：DHM)�；ㄇ嗨厥峭ㄟ^二氫黃酮醇 4-還原FR)，花青素合成酶 (ANS) 和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (UFGT) 的連續(xù)反應(yīng)合成的。在與分支點的 DFR 競爭時，單獨作用的 FLS 可以催化二氫黃酮醇生成黃酮醇。FLS 的在于可溶性 2-ODD，其需要輔助因子 2-氧代戊二酸，亞鐵（II）和抗壞血酸，并

27閱讀框 (1101bp)。設(shè)計 ORF 全長引物，以葡萄風(fēng)信子花發(fā)育的 5 個不同時期的 cDNA混合物為模板克隆得到兩條cDNA序列全長 (圖2-1)，ORF編碼366個氨基酸（圖2-2，2-3)，命名為 MaDFR 和 MaDFR1，MaDFR1 和課題組前期在葡萄風(fēng)信子‘白麗人’中克隆出來的氨基酸序列同源性為 100%，登錄號為 KJ619964；預(yù)測的蛋白分質(zhì)子量分別為40.93 KDa和41.00 KDa，將得到的MaDFR序列提交到GenBank，登錄號為MK937098。圖 2-1 葡萄風(fēng)信子 MaDFR 和 MaDFR1 基因編碼區(qū)的 cDNA 克隆M：Trans 2K plus DNA marker；泳道 1：MaDFR 基因全長擴(kuò)增；泳道 2：MaDFR1 基因全長擴(kuò)增。Figure 2-1 The cDNA clone of the coding region of MaDFR and MaDFR1 genes from grape hyacinthM

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 安維忠;劉雅莉;劉紅利;陳凱利;;葡萄風(fēng)信子MaANS基因及啟動子的克隆與分析[J];西北植物學(xué)報;2015年09期

2 焦淑珍;劉雅莉;婁倩;姜玲;;葡萄風(fēng)信子二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)的克隆與表達(dá)分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2014年05期

3 陳建;陳晨甜;呂長平;;觀賞植物花色形成影響因子研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代園藝;2009年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 陳凱利;葡萄風(fēng)信子MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子對花青苷合成的調(diào)控研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

2 婁倩;葡萄風(fēng)信子（Muscari）花色形成與相關(guān)基因研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

3 徐偉榮;中國華東葡萄抗白粉病芪合成酶基因及啟動子克隆與功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

本文編號：2776604