【摘要】：牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)在我國栽培歷史悠久,屬于名貴木本花卉,其不但具有很好的觀賞價(jià)值與藥用作用,在油用方面同樣具有較高的開發(fā)利用價(jià)值�！P丹’牡丹(Paeonia ostii‘Feng Dan’)為牡丹野生種楊山牡丹的栽培品種,是中國油用牡丹主要栽培品種。已經(jīng)有許多學(xué)者在‘鳳丹’牡丹組織培養(yǎng)方面進(jìn)行了嘗試并且取得了一定的成果,但是在試驗(yàn)過程中均發(fā)現(xiàn)組培材料褐變是‘鳳丹’牡丹快速繁殖體系建立的一大障礙,同時(shí)防褐劑在牡丹愈傷組織褐變過程中的作用機(jī)理還不夠明確。因此探究硝酸銀作為防褐劑在‘鳳丹’牡丹組織培養(yǎng)進(jìn)程中對(duì)褐變的抑制作用機(jī)理,能夠?yàn)椤P丹’牡丹褐化深層次原因分析以及新型防褐劑的開發(fā)提供理論支持。本試驗(yàn)中以‘鳳丹’牡丹組織培養(yǎng)獲得的增殖幼苗為材料,在含有0~5.0 mg·L~(-1)硝酸銀的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),并分三個(gè)時(shí)期進(jìn)行取材,測量愈傷組織中的總酚含量、單體酚、總黃酮和相關(guān)酶活性變化,并選取了在多酚類物質(zhì)合成途徑中有著重要的生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子和部分關(guān)鍵的酶類進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測,從分子層面檢驗(yàn)不同濃度的硝酸銀抑制愈傷組織褐變的效果和影響。主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)比外植體的生長情況后發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中加入硝酸銀能明顯減輕愈傷組織的褐變情況,其中2.0 mg·L~(-1)的綜合效果最好且對(duì)組培苗正常生長無影響。(2)通過高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn),硝酸銀對(duì)組培苗褐變過程中產(chǎn)生影響的單體酚有綠原酸、蘆丁、香豆酸、對(duì)香豆酸、表兒茶素、二氫槲皮素,其中蘆丁含量最高且相較其他幾種單體酚增幅也最大。(3)在硝酸銀的影響下‘鳳丹’牡丹愈傷組織中總酚含量、總黃酮含量與褐變等級(jí)呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P0.01),過氧化物酶(POD)活性與褐變程度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量與褐變程度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P0.05),超氧化物歧物酶(SOD)活性與褐變等級(jí)之間不存在顯著相關(guān)性。(4)通過對(duì)硝酸銀處理過的愈傷組織進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),多酚類物質(zhì)合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子MYB2、WD40-1、WD40-2與結(jié)構(gòu)基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黃烷酮醇還原酶(DFR)、查耳酮合酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、3-二氫黃酮羥化酶(F3H)、黃酮醇3’-羥化酶(F3’H)的表達(dá)量與褐變等級(jí)和總酚含量之間存在顯著的相關(guān)性(p0.05)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S685.11
【圖文】：

圖 1-2 類黃酮合成代謝途徑（Li 2008）Figure 1-2 Pathway of flavonoids biosynthesis的結(jié)構(gòu)基因外，還有部分基因通過合成轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)類黃酮的代謝（ Tonelli 2011）。參與類黃酮合成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子主要有 3 類，包括 MYB，bHLH 和YB 類轉(zhuǎn)錄因子可以單獨(dú)的調(diào)控某些類黃酮合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，或者與另外合體共同調(diào)控。此外，還有研究表明，MYB 還可以調(diào)節(jié) bHLH 和 WD40 的表達(dá)自身的表達(dá)情況外，還可以調(diào)節(jié)另外兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。由此可以看出，轉(zhuǎn)表達(dá)是一個(gè)十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并非某一個(gè)或幾個(gè)基因能夠決定的（Baudalez et al. 2008；Gonzalez et al. 2009；Jeong et al. 2010；Lea et al. 2007）。6

圖 1-3 類黃酮代謝途徑中的轉(zhuǎn)錄因子（Petroni and Tonelli 2011）Figure 1-3 Transcription factors in flavonoid biosynthesis pathway1.4.3 褐變現(xiàn)象中酚類物質(zhì)的研究現(xiàn)狀褐變現(xiàn)象又被稱為 “酚污染”（Balakrishnamurthy et al 1988）。組織培養(yǎng)過程中引起褐變的主原因?yàn)槊复俸肿�，酚類物質(zhì)作為酶促褐變反應(yīng)的底物，Dalal 等（1992）學(xué)者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其含量與變的發(fā)生具有正相關(guān)性，說明酚類是影響褐變水平的主要原因之一。酚類物質(zhì)的含量與外植體褐緊密相關(guān)(Luo et al. 1999;郭倩 2014)。1.5 防褐劑的選用在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，或在含抗氧化劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可大大減輕醌類物質(zhì)的害。選用適宜的抗氧化劑與吸收劑種類及含量是防止外植體褐變的常用的方法。試驗(yàn)中，常用到的抗氧化劑是硝酸銀、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭、植物凝膠、抗壞血( Vitamin C)、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）等。防褐劑的防褐效果因植物材料的不同而異。

注：a:‘鳳丹’組培苗在添加防褐劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 10 d；b:培養(yǎng) 30 d；c: 培養(yǎng) 50 d圖 3-3 不同濃度硝酸銀對(duì)‘鳳丹’牡丹愈傷組織單體酚含量的影響Figure 3-3 Effect of different concentrations silver nitrate on monomeric phenol content of Paeonia ostii‘Feng Dan’ callus3.3 不同濃度硝酸銀對(duì)組培苗酶活性的影響3.3.1 多酚氧化酶（PPO）活性變化分析PPO 被認(rèn)為是組培苗酶促褐變的主要原因之一，其底物在液泡中處于休眠狀態(tài)，只有在細(xì)胞膜遭到損傷而引起亞細(xì)胞區(qū)域化改變時(shí)才會(huì)被激活，從而引起褐變。圖表變化趨勢顯示：PPO 的活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)，在不同的取材階段 PPO 活性隨著硝酸銀濃度的增加先減弱后增強(qiáng)。當(dāng) AgNO3濃度為 2mg·L-1時(shí) PPO 活性在各處理組中均最低（圖3-4）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2775792