【摘要】：開(kāi)花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的重要轉(zhuǎn)變,是植物生長(zhǎng)發(fā)育的核心環(huán)節(jié)。這一質(zhì)變過(guò)程受到內(nèi)源激素和環(huán)境信號(hào)的共同調(diào)控,研究開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控機(jī)理對(duì)蔬菜作物的生產(chǎn)和育種具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前通過(guò)對(duì)擬南芥開(kāi)花途徑的深入研究,已確認(rèn)了六條開(kāi)花途徑。開(kāi)花相關(guān)基因構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不同的開(kāi)花途徑交匯并激活“開(kāi)花響應(yīng)元件”,FT基因就是“開(kāi)花響應(yīng)元件”之一。本研究對(duì)不結(jié)球白菜BcMAF2的低溫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了探索,并通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選與BcFT互作的蛋白。主要研究結(jié)果如下:1.不結(jié)球白菜'蘇州青'BcMAF 基因編碼一個(gè)192氨基酸分子的蛋白質(zhì),分子量為21.5×103Da,等電點(diǎn)為6.22,無(wú)跨膜區(qū)域。BcMAF2蛋白質(zhì)的N端1～60氨基酸之間含有一個(gè)保守的MADS-box結(jié)構(gòu)域,屬于MADS-box蛋白,與擬南芥AtMAF2編碼氨基酸相似性為72%。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示BcMAF2蛋白不僅位于細(xì)胞核,在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中均有分布。以'NHCC004'為材料,通過(guò)qRT-PCR分析BcMAF2及其同源基因在持續(xù)5周低溫(4℃)處理過(guò)程中的表達(dá)量變化:BcMAF2基因在低溫處理第14 d表達(dá)水平明顯上調(diào);BcFLC2的表達(dá)量隨春化處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,但在14～28d表達(dá)量幾乎不變;BcMAF3基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)最敏感,整個(gè)低溫處理階段表達(dá)水平明顯高于對(duì)照,在第28 d達(dá)到表達(dá)高峰;BcFLM與BcMAF4的表達(dá)水平呈現(xiàn)“低～高～低”的動(dòng)態(tài)變化,處理結(jié)束時(shí)表達(dá)量都低于春化前水平。2.誘餌載體pGBKT7-BcMAF2表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)自激活和自毒性。BcMAF2蛋白與BcSVP蛋白在體內(nèi)和體外均存在相互作用。BcMAF2蛋白還可以與BcFLC2蛋白互作;BcMAF4可形成同源二聚體;擬南芥中AtMAF3可分別與AtFLM、AtMAF4、AtFLC互作,但不結(jié)球白菜并無(wú)此現(xiàn)象,說(shuō)明BcMAF3蛋白可能在影響蛋白互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)存在某些化學(xué)修飾或突變,阻止蛋白相互作用,有待后續(xù)研究;BcSVP可以和BcMAF3外的其它蛋白兩兩互作,且自身可形成同源二聚體。3.利用亞細(xì)胞定位技術(shù)研究BcFT的空間表達(dá),發(fā)現(xiàn)BcFT蛋白在整個(gè)細(xì)胞中均有分布。構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-BcFT,驗(yàn)證其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)自激活和自毒性;對(duì)不結(jié)球白菜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,得到與BcFT互作的兩個(gè)蛋白BcPPD5和BcVHA-E1。對(duì)篩選得到的兩個(gè)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)二者均是親水性蛋白,不含信號(hào)肽,BcPPD5蛋白的氨基酸序列存在一個(gè)跨膜區(qū),二級(jí)結(jié)構(gòu)中不規(guī)則卷曲所占比例最大,163～296氨基酸殘基之間存在一個(gè)PsbP結(jié)構(gòu)域;BcVHA-E1蛋白無(wú)跨膜區(qū),二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋所占比例最大,無(wú)特定結(jié)構(gòu)域。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S634.3
【圖文】：

不結(jié)球白菜開(kāi)花基因尸２的低溫應(yīng)答及ｇｃＦｒ的互作蛋白篩選的分子式為Ｃ９２５Ｈ１５５２Ｎ２７0０３0５Ｓ５，含有１９２個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為２１．５ｘ點(diǎn)為６．２２，其中包含正電殘基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）邋２８?jìng)�(gè)，負(fù)電殘基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）邋白的不穩(wěn)定系數(shù)為５８．１４，脂肪系數(shù)為９７．４０，平均親水性系數(shù)為－０．４９６。Ｐ酸疏水性圖譜（圖１－１－Ａ）顯示該蛋白的Ｃ端和Ｎ端都偏向親水性，中間疏水性交替出現(xiàn)，總體而言親水性表現(xiàn)更強(qiáng)。ＤＡＳ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ預(yù)測(cè)區(qū)域。根據(jù)ＢｃＭＡＦ２的氨基酸序列，利用ＳＯＰＭＡ進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，，ＢｃＭＡＦ２蛋白中ａ螺旋所占比例最大，為４９．４８％；不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)次２３．９６％邋；邋ｐ轉(zhuǎn)角所占比例最少，僅為８．３３％。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ預(yù)測(cè)６９？１０６及１７１？１８７氨基酸之間，富集蛋白結(jié)合位點(diǎn)，可能是蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域。該蛋白１？６０個(gè)氨基酸殘基之間存在一個(gè)ＭＡＤＳ結(jié)構(gòu)域（圖１－１－Ｂ）。ＭＡ白通常形成二聚體，以保守的ＭＡＤＳ結(jié)構(gòu)域結(jié)合下游基因ＤＮＡｒＧ－ｂｏｘ，實(shí)現(xiàn)其調(diào)控功能。逡逑

Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ邋ｓｑ邋ｇ邐ｓ邋ｎ邋ｓｇ邋ｅｔｌｐｌｌ逡逑圖２－３邋／ＩｒＭ／ｍ和５ｃＡ＾Ｆ２氨基酸序列同源性比較逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ＡｔＭＡＦ２邋ａｎｄ邋ＢｃＭＡＦ２逡逑在擬南芥中，ＪＭＭＦ２有５個(gè)同源基因，Ｊ／ＦＺＪｌ／、其逡逑中／ｉｒＦＬＭ位于染色體Ｉ，ＡＦＺＣ位于染色體Ｖ邋，邐在染色體Ｖ上串聯(lián)逡逑重復(fù)排列，形成一個(gè)２２－ｋｂ的基因簇。這些基因形成一個(gè)小的基因家族，在調(diào)控開(kāi)花逡逑過(guò)程中行使各自的功能。與此相似，不結(jié)球白菜的同源基因有逡逑ＢｃＦＬＣｌ？ＢｃＦＬＣ３、ＢｃＦＬＭ、ＢｃＭＡＦ３、ＢｃＭＡＦ４，Ｘｉａｏ（２Ｑ＼３、ｉＫ為邋ＢｒＦＬＣ２邋是＆菜邋４邋個(gè)逡逑５ｒＦＬＣ＾基因中調(diào)控開(kāi)花的關(guān)鍵基因，在不結(jié)球白菜中對(duì)應(yīng)的是５ｃｆＺＣ２。利逡逑用ＤＮＡＭＡＮ８．０軟件分析這些同源基因的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果如圖１－４，與逡逑最先聚類(lèi)

邐１４０邐１６８逡逑圖２－２邋ＢｃＭＡＦ２蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)逡逑藍(lán)色表示ｏｔ螺旋，綠色表示ｐ轉(zhuǎn)角，紅色表示延伸鏈，紫色表示不規(guī)則卷曲逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＢｃＭＡＦ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ｂｌｕｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ａｌｐｈａ邋ｈｅｌｉｘ，邋ｇｒｅｅｎ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｂｅｔａ邋ｔｕｒｎ，邋ｒｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ逡逑ｅｘｔｅｎｄｅｄ邋ｓｔｒａｎｄ，邋ｐｕｒｐｌｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｒａｎｄｏｍ邋ｃｏｉｌ逡逑２．２邋ＢｃＭＡＦ２氨基酸序列同源性比較及同源基因進(jìn)化分析逡逑下載擬南芥序列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ），對(duì)擬南芥和不結(jié)逡逑球白菜Ｍ４Ｆ２的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果如圖１－３，二者氨基酸序列相似度逡逑為７２％

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本文編號(hào)：2763433