發(fā)布時(shí)間：2020-07-18 21:57

【摘要】：銅鋅超氧化物歧化酶(CSD)是植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中的關(guān)鍵酶,其含量和活性與植物抗逆性密切相關(guān)。CSD基因已在多種植物中完成了克隆與功能鑒定,而關(guān)于結(jié)縷草CSD基因的報(bào)道很少。本研究以結(jié)縷草cDNA為模板,利用同源克隆法,從結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了結(jié)縷草ZjCSD1基因,該基因編碼一個(gè)含有152個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明:ZjCSD1基因編碼蛋白為穩(wěn)定的、親水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,含有CSD蛋白家族特有的保守結(jié)構(gòu)域,具有典型的Cu2+和Zn2+結(jié)合位點(diǎn);與小米、玉米等禾本科植物具有較高的同源性,親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位表明ZjCSD1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究該基因在不同組織中、不同脅迫處理下的表達(dá)模式,結(jié)果表明:ZjCSD1基因在結(jié)縷草的根、莖和葉中都有表達(dá),且葉中的表達(dá)量最高;干旱脅迫(30%PEG)、鹽脅迫(150 mM NaCl)和Cd2+脅迫(200 mg/l Cd2+)均能誘導(dǎo)ZjCSD1基因表達(dá)量上調(diào),Pb2+脅迫(1 g/1 Pb2+)誘導(dǎo)ZyjCSSD1基因表達(dá)量下調(diào)。因此結(jié)縷草ZjCSD1基因響應(yīng)干旱、鹽和重金屬脅迫。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,在禾本科模式植物水稻中過(guò)表達(dá)ZjCSD1基因,成功獲得并鑒定了 102個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系。轉(zhuǎn)基因子代的表型有待后續(xù)試驗(yàn)探究。CSD的激活主要依賴于其銅分子伴侶蛋白,銅鋅超氧化物歧化酶銅分子伴侶蛋白(CCS)是一種胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其功能是通過(guò)蛋白間相互作用,將銅離子運(yùn)輸給CSD,進(jìn)而激活CSD。在本實(shí)驗(yàn)室前人研究的基礎(chǔ)上,本文通過(guò)RACE擴(kuò)增得到了ZjCCS基因ORF前的75個(gè)堿基序列以及3種不同長(zhǎng)度的3'-UTR序列,同時(shí)發(fā)現(xiàn)ZjCCS基因可以從兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄。亞細(xì)胞定位分析表明ZjCCS全長(zhǎng)蛋白定位于葉綠體,而去掉轉(zhuǎn)運(yùn)肽的ZjCCS蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究ZjCCS基因在結(jié)縷草不同組織中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)ZjCCS基因在根、莖和葉中都有表達(dá),且葉中的表達(dá)量最高,根中的最低。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,在水稻中過(guò)表達(dá)ZjCCS基因,成功獲得并鑒定了 30個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系。轉(zhuǎn)基因子代的表型有待后續(xù)試驗(yàn)探究。此外,通過(guò)酵母雙雜和BiFC證明了去掉葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)縷草ZjCCS蛋白能夠與ZjCSD1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中互作,且ZjCCS第160～286個(gè)氨基酸區(qū)段在互作的過(guò)程中至關(guān)重要。綜上所述,本文對(duì)結(jié)縷草ZjCSD1和ZjCCS基因進(jìn)行了克隆與功能初步研究,有利于進(jìn)一步了解CSD和CCS基因在結(jié)縷草應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中的作用,并為后期研究結(jié)縷草中CCS激活CSD的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S688.4
【圖文】：

完成了基因組測(cè)序，因此被廣泛用于遺傳和分子研究。植物是復(fù)雜的多細(xì)胞生物，在逡逑運(yùn)輸銅等必需微量營(yíng)養(yǎng)素的過(guò)程中要通過(guò)較長(zhǎng)的距離，且在到達(dá)靶位點(diǎn)之前需要跨越逡逑多個(gè)膜系統(tǒng)。如圖１－２所示，ＣＯＰＴ１是一種類Ｃｔｒ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，銅離子在ＣＯＰＴ１的作逡逑用下從質(zhì)外體跨過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再由銅伴侶蛋白螯合或運(yùn)輸至靶標(biāo)。ＣＯＰＴ１逡逑７逡逑

２．３．２結(jié)縷草Ｚｙ‘ＣＳＺ）７基因編碼蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征分析逡逑利用在線工具Ｐｒｏｔｐａｒａｍ預(yù)測(cè)ＺｙＣＳＴ）／基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明逡逑該蛋白相對(duì)分子量為１５．０８３６ｋＤ，分子式為Ｃ６４４Ｈｕ）２９Ｎ１９７０２１６Ｓ３，理論等電點(diǎn)５．７６。由逡逑１８種氨基酸組成，其中Ｇｌｙ占１９．７％，比例最高。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為］４．５０邋（＞４０逡逑時(shí)不穩(wěn)定），脂溶指數(shù)為７７．６３，總平均疏水指數(shù)為－０．２５７。因此推測(cè)該蛋白是穩(wěn)定的、逡逑酸性、親水脂溶蛋白。利用ＴＭＨＭＭ２．０在線工具預(yù)測(cè)ＺｊＣＳＤ］蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，逡逑結(jié)果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋白無(wú)跨膜螺旋，整條肽鏈都位于膜外；利用在線工具ＳｉｇｎａｌＰ邋４．１逡逑對(duì)ＺｊＣＳＤｌ蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ＺｊＣＳＤｌ蛋白Ｎ端不含信號(hào)肽，為非分逡逑泌蛋白；利用ＴａｒｇｅｔＰ邋１．１對(duì)ＺｊＣＳＤｌ蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋逡逑白位于細(xì)胞質(zhì)中。綜上推測(cè)ＺｊＣＳＤｌ蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)中的非分泌蛋白。逡逑２．３．３結(jié)縷草Ｚｙ＿Ｃ５Ｄ７基因編碼氨基酸序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析逡逑在ＮＣＢＩ中，利用Ｂｌａｓｔ檢索并下載與結(jié)縷草ＺｙＣＳＤＹ基因編碼的氨基酸序列相逡逑似性較高的序列，在ＤＮＡＭＡＮ中進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，ＺＪＣＳＤ／基因編碼的氨基酸逡逑序列與玉米中的相似性達(dá)９１％，與二穗短柄草、獐茅、歐洲大葉楊等相似性達(dá)逡逑８５°／。？８９％。另外，ＣＳＤ蛋白的不同氨基酸區(qū)段序列保守程度不同，Ｃ端序列較Ｎ端逡逑

圖２－５邋ＺｊＣＳＤｌ蛋白與其他物種ＣＳＤ蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字表示逡逑ｂｏｏｔｓｔｒａｐ驗(yàn)證重復(fù)１０００次該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＺｊＣＳＤｌ邋ａｎｄ邋ＣＳＤ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒｕｎｃｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｐｅｒｃｅｎｔ邋ｏｆ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｐ邋ｖａｌｕｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．逡逑２２逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 馮勛偉;才宏偉;;結(jié)縷草CBF基因的同源克隆及其轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性驗(yàn)證[J];作物學(xué)報(bào);2014年09期

2 張玉秀;金玲;馮珊珊;劉金光;柴團(tuán)耀;;鎘對(duì)鎘超累積植物龍葵抗氧化酶活性及基因表達(dá)的影響[J];中國(guó)科學(xué)院研究生院學(xué)報(bào);2013年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 樊波;結(jié)縷草中鹽脅迫響應(yīng)基因的克隆與功能研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：2761481