【摘要】：抗菌肽在農業(yè)、食品、醫(yī)療等領域中具有較高的應用價值,因此被越來越多的研究人員所關注。篩選這些肽及其編碼基因的傳統(tǒng)技術較為繁瑣,并且篩選到新編碼基因的概率較低。本研究針對上述問題,利用枯草芽孢桿菌分泌表達系統(tǒng),建立了一種全新高效的抗菌肽篩選策略。本研究利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)建立大蒜cDNA表達文庫,與本實驗室保存的大腸桿菌系統(tǒng)大蒜cDNA表達文庫一起評估文庫質量并進行后續(xù)篩選。以抗菌蛋白對宿主細胞的傷害作為指標,初步篩選在胞內具有抑菌活性的蛋白�？莶菅挎邨U菌系統(tǒng)篩選到53個候選抗菌蛋白,大腸桿菌系統(tǒng)篩選到170個候選抗菌蛋白。通過掃描電子顯微鏡觀察到,候選抗菌蛋白的菌體均表現(xiàn)出破損或縮皺的現(xiàn)象。提取上述候選抗菌蛋白的粗蛋白,在體外測試抑菌活性,結果表明,枯草芽孢桿菌系統(tǒng)大蒜cDNA文庫篩選出11個具有廣譜抑菌活性的肽,經測序均為未經過報道的基因。而大腸桿菌系統(tǒng)只篩選出1個具有抑菌活性的肽。因此,經過兩個篩選系統(tǒng)的對比,證實了枯草芽孢桿菌系統(tǒng)篩選抗菌肽更加的高效、穩(wěn)定。利用生物信息學預測抗菌肽的二級結構、等電點、分子質量等性質,根據(jù)二級結構將肽分成四類,結合抑菌數(shù)據(jù),推測同時具有α-螺旋和β-折疊的這類肽具有較好的抑菌活性。為了探究抗菌肽的應用潛能,對抗菌肽進行溶血實驗與熱穩(wěn)定性實驗,結果證實,在肽濃度高達1000μg/mL時溶血活性基本低于5%,并且部分肽在100℃高溫下仍具有一定的抑菌活性。在離體的煙草葉片上涂抹抗菌肽,能夠不同程度的抑制辣椒疫霉侵染。將純化后的抗菌肽AsR416處理細菌細胞,實驗結果證實細菌的細胞膜受到了損傷,說明篩選到的抗菌肽能夠破壞細胞膜的完整性。綜上所述,本研究提供了一種新穎、靈敏且高通量分離抗菌基因的策略,并篩選到11個具有廣譜抗性的新基因。根據(jù)本文的研究結果,植物和人類病原細菌、真菌甚至是癌細胞都有作為此篩選策略中靶標指示物的可能性,以達到針對性的篩選特異抗性基因的目的。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S633.4
【圖文】：

利用枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)進行大蒜抗菌基因篩選及功能研究anne and Harwood 2010)。信號肽通常由較短的氨基酸組成，并在蛋白目的地后會立即被特異性信號肽酶和信號肽肽酶（SPP 酶）去除和降合成后通過不同的機制運輸?shù)侥康牡?Westers et al 2015)。為了適應不，枯草芽孢桿菌進化出了幾種途徑來滿足這一要求：一般蛋白質分，雙精氨酸途徑（Tat）和 ATP 結合盒（ABC）轉運蛋白（圖 1-3）。

還有其他提高分泌效率的方法（圖1-4）。例如，人為制造缺失蛋白酶的菌株，去除不必要的基因組序列(Kenji et al 2011,Manabe et al 2013)，或者優(yōu)化代謝工程技術等等。通過基因組學和蛋白質組學的結合，利用合成生物學的方法可以改善工業(yè)中蛋白質的生產。

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