【摘要】：梨銹水病是一種由細(xì)菌引起的病害,1973年在江蘇省北部區(qū)域,部分梨樹出現(xiàn)了主干流出鐵銹色的粘性液體的病癥,發(fā)病梨樹輕則落葉減產(chǎn)重則整株枯死,給果農(nóng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)采樣分析后發(fā)現(xiàn)這是一種從未被報(bào)道過(guò)的細(xì)菌病害。發(fā)病梨樹的主要癥狀主要是在枝干上產(chǎn)生帶有酒糟氣味的鐵銹色粘液,故而取名“梨銹水病”,近年來(lái)梨銹水病在浙江、山東、德州也時(shí)常發(fā)生。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定,梨銹水病原菌為迪基氏茵(Dickeya)屬下的一個(gè)未報(bào)道的種,本實(shí)驗(yàn)室將其命名為方中達(dá)迪基氏菌D.fangzhongdaisp.nov.。在植物檢疫方面,梨銹水病的發(fā)病癥狀與檢疫性病害梨枯枝病類似,通過(guò)傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)難以區(qū)分。并且由于梨銹水病原菌是一種新的病原菌,目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有建立對(duì)其的分子檢測(cè)技術(shù),因此本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,建立梨銹水病原菌的分子檢測(cè)方法,能夠?qū)驿P水病菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè),對(duì)病害的防治做出有益貢獻(xiàn)。首先,本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)中的Blast比對(duì)方法將梨銹水病原菌與其他13種近緣菌進(jìn)行全基因組對(duì)比,篩選出10個(gè)具有特異性位點(diǎn)的同源基因,并針對(duì)這些具有特異性位點(diǎn)的基因片段設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。其次,對(duì)于10對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR的驗(yàn)證,篩選出兩對(duì)特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物,分別是根據(jù)胞外多糖基因cpsB以及hrp基因簇hrpV基因設(shè)計(jì)的特異性引物。這兩對(duì)引物只能擴(kuò)增梨銹水菌的特異性片段,對(duì)其屬內(nèi)的其他菌種及部分遠(yuǎn)緣細(xì)菌均無(wú)條帶生成說(shuō)明其高度的特異性,并且靈敏度可達(dá)10 pg/μL。以此建立了梨銹水病的PCR的檢測(cè)方法。最后,設(shè)計(jì)了以同源基因hrpV同源基因?yàn)榘袠?biāo)的特異性TaqMan探針和引物,建立了梨銹水病原菌的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法。檢測(cè)靈敏度可達(dá)20copies/μL,是普通PCR檢測(cè)方法的100倍,在一個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以完成檢測(cè)。本研究建立的普通PCR檢測(cè)方法方便快捷,且成本低廉。熒光定量PCR方法靈敏度更高,用時(shí)更短,二者均能較好地將梨銹水病菌和其他迪基氏菌種區(qū)分,填補(bǔ)了梨銹水病分子檢測(cè)的空白,為檢測(cè)梨銹水病提供了新的方法。丁香假單胞菌黃瓜致病變種(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的黃瓜細(xì)菌性角斑病在世界范圍內(nèi)皆有發(fā)生,造成不同程度的損失,同時(shí)也引起甜瓜細(xì)菌性葉斑病。以往研究表明黃瓜和甜瓜細(xì)菌性角斑病的病原均為丁香假單胞菌黃瓜致病變種,但在本實(shí)驗(yàn)室的研究中發(fā)現(xiàn),丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系和甜瓜株系在致病性和分子生物學(xué)上存在一定差異。本研究利用Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌黃瓜株系和甜瓜株系的碳代謝活力分別進(jìn)行了測(cè)定與比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丁香假單胞菌黃瓜株系和甜瓜株系屬于不同的基因種。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.612.1
【圖文】：

會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)便能知道目的產(chǎn)物的生成量。第二種是ＲｇＭａｎ探針?lè)�，這種方法是建立在熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理上的（Ｃｌｅｇｇ，邋１９９５）。這種方法的心是設(shè)計(jì)一條特異的熒光探針，熒光探針是一條含有特異性位點(diǎn)的２０－３０ｂｐ的寡核酸，其退火溫度略高于引物，在探針的５’端添加報(bào)告熒光基團(tuán)，３’端添加淬滅熒基團(tuán)。當(dāng)反應(yīng)開始時(shí)，；Ｔ＾Ｍａｎ探針是完整的，探針５’端添加的熒光基團(tuán)發(fā)射的熒信號(hào)被３’端的淬滅熒光基團(tuán)吸收，此時(shí)沒(méi)有熒光信號(hào)的產(chǎn)生。在反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中７１＾酶會(huì)水解ｒ＾Ｍａｎ探針，使得報(bào)告熒光基團(tuán)游離在體系之中，淬滅熒光基團(tuán)無(wú)法吸其發(fā)出的熒光信號(hào)，此時(shí)儀器便能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到反應(yīng)中的熒光信號(hào)。兩種實(shí)時(shí)熒光定ＰＣＲ的方法各有利弊，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ邋Ｉ法成本較低，但耗時(shí)較長(zhǎng)，７ｌ＾Ｍａｎ探針?lè)ǖ墓馓结樦谱鞒杀据^高，還有添加ＭＧＢ基團(tuán)以增加熱穩(wěn)定性的７ｉ＾Ｍａｎ邋ＭＧＢ探針，往往在一個(gè)小時(shí)內(nèi)就能完成檢測(cè)，目前此方法在植物檢測(cè)病害方面也得到了許多應(yīng)逡逑用。初次將熒光定量ＰＣＲ方法引入應(yīng)用于植物病害檢測(cè)領(lǐng)域的是Ｂｏｈｍ等（１９９９），邋２００年有學(xué)者首次運(yùn)用熒光定量ＰＣＲ方法檢測(cè)了真菌植物病害（Ｒｅｉｄ，２０００）。在中國(guó)，運(yùn)逡逑用熒光定量技術(shù)對(duì)對(duì)植物病原微生物進(jìn)行定量分析的時(shí)間還不長(zhǎng)，程穎慧等（２００２）立了小麥印度腥黑穗病菌的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)。逡逑ＴａｑＩＶｌａｎ＇＊邐＿逡逑＇

３．２鎖式探針技術(shù)（Ｐａｄｌｏｃｋ）逡逑環(huán)狀寡核苷酸探針即鎖式探針，己經(jīng)證明在基因檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，包括逡逑原位分析、基因分型和基因表達(dá)的測(cè)量等（Ａｎｔｓｏｎ，邋２０００）。瑣式探針檢測(cè)技術(shù)是一種以逡逑連接酶介導(dǎo)的分子檢測(cè)技術(shù)（Ｎｉｌｓｓｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９９４）。鎖式探針（ＰＬＰｓ）是一段長(zhǎng)的核苷酸逡逑鏈，探針的末端與目標(biāo)序列互補(bǔ)。在與目標(biāo)序列雜交后，探針的兩端接觸，通過(guò)連接逡逑使探針環(huán)化。探針有非常特異的靶標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，緊接著的是普通的ＰＣＲ擴(kuò)增和斑點(diǎn)逡逑雜交（Ｓｚｅｍｅｓ，２００５）。成環(huán)的探針會(huì)在ＰＣＲ中被成倍擴(kuò)增，斑點(diǎn)雜交后會(huì)出現(xiàn)顏色反逡逑應(yīng)，而未能與目標(biāo)基因配對(duì)的探針會(huì)被外切酶降解。以此可以判斷待測(cè)樣品中是否存逡逑在目標(biāo)病原菌。鎖式探針技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)出單堿基的差異，大大減輕了探逡逑針與引物設(shè)計(jì)的難度，而且其靈敏度也較高。劉達(dá)等（２０１３）利用瑣式探針技術(shù)檢測(cè)瓜逡逑蔓枯病菌，檢測(cè)靈敏度可達(dá)２００邋ｆｇ是常規(guī)ＰＣＲ檢測(cè)靈敏度的１００倍，完全滿足了曰逡逑常檢疫工作中的要求。陳艷鴻等（２０１５）以ＤＮＡ復(fù)制和修復(fù)蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)，建立了基逡逑于鎖式探針結(jié)合正向斑點(diǎn)雜交技術(shù)的地毯草黃單胞菌大豆致病變種檢測(cè)體系檢測(cè)靈逡逑敏度達(dá)到ｌＯＯｆｇ／ｐＬ。逡逑

邐梨銹水病的分子檢測(cè)技術(shù)研究邐逡逑光顯色即可完成檢測(cè)。其檢測(cè)靈敏度為２０邋ｃｆｏ／ｍＬ。該方法為西瓜嗜酸菌的檢疫及其逡逑所致病害的快速診斷提供了新的技術(shù)。逡逑

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