【摘要】：番茄是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,因為其果實多層次的口感和豐富的營養(yǎng)元素深受大家的歡迎。但番茄作為喜溫性茄果類,一旦遭遇低溫脅迫就會造成品質(zhì)受損、產(chǎn)量下降等傷害,帶給種植者不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。小熱激蛋白(small heat shock proteins,sHSP),是一類植物遭受高溫、低溫、鹽堿、機(jī)械損傷等生物、非生物脅迫時產(chǎn)生的能夠?qū)χ参锲鸬奖Ｗo(hù)作用的蛋白。sHSPs不僅在熱脅迫等逆境下具有保護(hù)細(xì)胞的分子伴侶屬性,而且一些sHSPs在果實發(fā)育、冷藏期間以及冷藏后的恢復(fù)過程起重要作用,但sHSPs在果實發(fā)育中的確切作用及耐冷的分子機(jī)制目前還不清楚。本研究以闡明定位在細(xì)胞質(zhì)中的ClassI小熱激蛋白17.7(ClassI small heat shock protein 17.7,CI-HSP17.7)基因在低溫脅迫下的功能為研究目標(biāo),通過對耐低溫型克梅留斯基番茄(Solanum chmielewskii)和低溫敏感型Moneymaker番茄果實成熟時期CI-HSP17.7的表達(dá)特點分析,進(jìn)一步構(gòu)建CI-HSP17.7基因的RNA干擾載體和過表達(dá)載體,并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定,主要研究結(jié)果如下:1)采用實時定量PCR技術(shù)分析CI-HSP17.7在兩種糖積累型番茄中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示:在蔗糖積累型克梅留斯基番茄綠熟時期、己糖積累型Moneymaker番茄轉(zhuǎn)色時期表達(dá)量最高。2)利用Gateway技術(shù)將PCR產(chǎn)物與中間載體pENTR/D-TOPO連接形成pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7載體,檢測正確后將pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7載體與最終載體體pB7GWIWG2(I)進(jìn)行LR反應(yīng),然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌,測序成功后得到CI-HSP17.7沉默載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法建立克梅留斯基沉默遺傳轉(zhuǎn)化體系,經(jīng)過鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因株系即RNAi株系70株。利用限制性內(nèi)切酶BgIII和BstEII構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA3301-CI-HSP17.7,然后進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法建立Moneymaker番茄過表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化體系,經(jīng)過鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株即OE株系55株。3)分別取30個相同時期的轉(zhuǎn)基因果實和正常果實,進(jìn)行果實橫徑和縱徑的測量,與對照組相比RNAi果實的橫徑、縱徑、重量都有明顯的減少,而OE果實與對照組相比橫徑、縱徑、和重量有小幅度上升。4)通過對低溫處理下兩組果實中CI-HSP17.7基因表達(dá)量分析可知:當(dāng)對正常果實進(jìn)行低溫處理時,果實中CI-HSP17.7基因含量會增加并且隨著處理時間的增加會有上升的趨勢,對于RNAi果實來說CI-HSP17.7基因表達(dá)量不僅比正常果實低而且在遭遇低溫時表達(dá)量改變不大,而對于OE果實來說其CI-HSP17.7基因表達(dá)量比正常果實高而且在遭遇低溫處理后表達(dá)量上升趨勢更加明顯。這說明低溫可以誘導(dǎo)CI-HSP17.7基因含量的上升。5)低溫處理克梅留斯基番茄后,正常果實中三種可溶性糖含量變化明顯,其中蔗糖含量明顯上升而果糖葡萄糖含量明顯下降,說明克梅留斯基番茄通過積累蔗糖來抵抗低溫脅迫。RNAi果實三種可溶性糖含量對比于正常果實下降明顯。低溫處理后RNAi果實,三種可溶性糖含量對比于正常果實下降明顯但是低溫處理后變化趨勢不明顯,蔗糖沒有積累過程。這說明RNAi番茄耐低溫性下降。OE番茄三種可溶性糖含量相比于對照組正常番茄都有所上升,低溫處理下正常番茄果實果糖葡萄糖含量上升而蔗糖含量下降,這說明Moneymaker番茄通過積累果糖和葡萄糖來抵抗低溫脅迫。而對于OE番茄低溫處理后三種可溶性糖含多于正常果實,而且果糖和葡萄糖積累趨勢更加明顯,這說明OE番茄耐低溫性增加。通過分析兩組轉(zhuǎn)基因番茄低溫脅迫下糖含量的變化可以說明CI-HSP17.7基因?qū)Φ蜏孛{迫存在響應(yīng),CI-HSP17.7基因可能提高果實的耐寒性。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S641.2
【圖文】：

結(jié)果與分析3 結(jié)果與分析3.1 CI-HSP17.7 基因在番茄果實成熟過程中的表達(dá)特點為了探究 CI-HSP17.7 基因在番茄果實成熟過程中的表達(dá)特點，我們在開花前 2 天、開花當(dāng)天、開花后 7 天、14 天、21 天、果實綠熟時期、轉(zhuǎn)色時期和完熟時期分別取樣，然后提取樣品的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(圖 1，圖 2)。如圖 1 所示：以克梅留斯基番茄開花前 2 天狀態(tài)中 CI-HSP17.7 基因表達(dá)量為對照，開花當(dāng)天、花后 2 天、花后 7 天、14 天、21 天還有果實綠熟時期和完熟時期 CI-HSP17.7基因表達(dá)量跟對照相比都有顯著提高，其中在綠熟時期和完熟時期表達(dá)量最高，相對對照上調(diào)了 100 倍和 53 倍。這說明 CI-HSP17.7 基因在克梅留斯基番茄果實發(fā)育的過程中表達(dá)量逐漸升高，其中在綠熟時期表達(dá)量最高。

圖 2 Moneymaker 番茄果實成熟過程中的 CI-HSP17.7 相對表達(dá)水平Fig.2 The relative expression level of CI-HSP17.7 in Moneymaker tomato.BR，轉(zhuǎn)色時期果實；RR，紅熟時期果實。BR,break fruit; RR, red pipening.3.2 CI-HSP17.7 沉默載體的構(gòu)建與檢測3.2.1 CI-HSP17.7 cDNA 片段的獲得根據(jù)已知的CI-HSP17.7 的cDNA全長，用RNA干擾原理設(shè)計出沉默引物，用引物S17.7-F和S17.7-R對CI-HSP17.7 沉默片段進(jìn)行擴(kuò)增，沉默片段在204bp-358bp之間片段大小為155bp。結(jié)果如圖3所示：用瓊脂糖凝膠檢測已擴(kuò)增出目的片段。

圖 3 CI-HSP17.7 基因目的片段的 PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Amplication of CI-HSP17.7 target fragment 擴(kuò)增 CI-HSP17.7 基因目的片段；M：DL 1000 Marker(下同)；1、3： PCR CI-HSP17.7 擴(kuò)SP17.7 gene amplification; M: DL 1000 DNA(The same as below); 1、3: PCR products of CI-H載體的構(gòu)建及檢測SP17.7沉默載體的構(gòu)建采用Gateway技術(shù)，首先將CI-HSP17.7基因的間載體TOPO載體上，形成pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7載體，然后在反應(yīng)進(jìn)而轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)上，經(jīng)過篩選培養(yǎng)基篩選挑取單菌落。S17.7-R對CI-HSP17.7沉默載體進(jìn)行菌液RCR檢測。檢測結(jié)果如下圖出大小為155bp的條帶。選取條帶較亮的菌液進(jìn)行測序，測序成功后行下一步將其轉(zhuǎn)化成農(nóng)桿菌。

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