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野生毛葡萄液泡膜水通道蛋白基因的克隆與功能驗(yàn)證

發(fā)布時(shí)間:2020-07-05 10:16
【摘要】:水通道蛋白在介導(dǎo)植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸、維持水分平衡,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡及應(yīng)對各種非生物脅迫中起著極其重要的作用。中國西南喀斯特山區(qū)的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis),經(jīng)過長期的干旱-復(fù)水-再干旱模式的馴化,形成特有的抗旱性。為了探究喀斯特地區(qū)野生毛葡萄液泡膜水通道蛋白的結(jié)構(gòu)特征,及其在干旱脅迫中所發(fā)揮的作用,本研究以極抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’為研究對象,不抗旱的歐洲葡萄(V.vinifera)‘紅地球’為對照組材料,利用同源序列分析及RT-PCR的方法克隆得到野生毛葡萄的液泡膜水通道蛋白(TIPs)基因全長,分析了各基因的生物信息學(xué)特征、不同組織中及土壤干旱-復(fù)水條件下各基因的表達(dá)規(guī)律,研究了基因表達(dá)與水分脅迫生理指標(biāo)的相關(guān)性關(guān)系,全面探究TIPs基因與野生毛葡萄抗旱性的關(guān)系,構(gòu)建了基因表達(dá)載體,并成功將VhTIP2;1導(dǎo)入擬南芥進(jìn)行了部分功能驗(yàn)證。主要取得以下研究結(jié)果:1.利用同源序列分析及RT-PCR法從‘花溪-9’中克隆出9個液泡膜水通道蛋白基因(VhTIP)的全長cDNA序列。9個TIP基因分別命名為:VhTIP1;1(KY379060)、VhTIP1;2(KY379061)、VhTIP1;3(KY391793)、VhTIP1;4(KY391794)、VhTIP2;1(KP276237)、VhTIP2;2(KY379062)、VhTIP3;1(KY922959)、VhTIP4;1(KY379063)、VhTIP5;1(KY922960),分別包含756、756、756、759、750、753、780、762、750 bp的完整開放閱讀框。2.經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測,9個VhTIPs氨基酸序列均具有MIP家族信號序列SGGHINPAVT以及兩個NPA(Asn-Pro-Ala)單元,分別編碼251、251、251、252、249、250、259、253、249個氨基酸。將VhTIPs進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)這9個VhTIPs的相對分子質(zhì)量在25.27 kD~27.42 kD之間,理論等電點(diǎn)(pI)在4.96~7.11之間,不穩(wěn)定系數(shù)在26.47~35.89之間,均為穩(wěn)定性蛋白。經(jīng)親水性檢測,VhTIPs蛋白的親水平均數(shù)均在0.657~0.923之間,為疏水性蛋白。利用TMHMM-2.0軟件預(yù)測了VhTIPs蛋白的跨膜區(qū),除VhTIP1;4含有7個跨膜區(qū)外,其他8個均含有6個跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP3.0 Server對VhTIPs進(jìn)行信號肽預(yù)測,9個VhTIPs蛋白均無信號肽。利用Plant-mPLoc在線軟件對這9個基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位,均定位在液泡膜上。3.組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)9個TIP基因中的TIP1;4、TIP2;1、TIP2;2及TIP4;1在極抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’和不抗旱的歐洲葡萄‘紅地球’的根中表達(dá)量均最高,且在‘花溪-9’中的表達(dá)量高于‘紅地球’的,可能與根部水分運(yùn)輸、根壓的調(diào)節(jié)及抗旱性的強(qiáng)弱相關(guān),TIP1;4及TIP2;2只在根中特異表達(dá),莖和葉中幾乎檢測不到,說明此基因主要作用于根部的水分運(yùn)輸。TIP1;2在‘花溪-9’葉中的表達(dá)量最高,莖中次之,根中最少,但在‘紅地球’的根莖葉中幾乎沒有表達(dá)量,預(yù)測該基因可能參與了‘花溪-9’抗旱性調(diào)節(jié);TIP1;3在‘花溪-9’和‘紅地球’中的葉中表達(dá)量最高,根中檢測不到其表達(dá)量,可能主要參與葉片的水分轉(zhuǎn)運(yùn)。4.在干旱脅迫過程中,‘花溪-9’根中VhTIP1;1和VhTIP5;1基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,VhTIP1;2和VhTIP2;1呈先降低后升高趨勢;復(fù)水7d后VhTIP1;1、VhTIP2;1、VhTIP3;1、VhTIP4;1和VhTIP5;1表達(dá)量恢復(fù)到對照水平;‘紅地球’根中VvTIP1;4和VvTIP5;1基因也能恢復(fù)到對照水平。在莖中,‘花溪-9’的VhTIP5;1以及‘紅地球’的VvTIP2;2可恢復(fù)至對照水平�!ㄏ�-9’葉中的VhTIP1;3和VhTIP1;4及‘紅地球’的VvTIP2;1也可恢復(fù)至對照水平。5.干旱脅迫下,光合參數(shù)(凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率)、葉水勢、葉片相對含水量和水力結(jié)構(gòu)參數(shù)(導(dǎo)水率、葉比導(dǎo)率和比導(dǎo)率)會隨著干旱脅迫時(shí)間的延長逐漸降低,根、莖和葉的質(zhì)膜相對透性逐漸增大,細(xì)胞膜的通透性變大,穩(wěn)定性逐漸降低;復(fù)水后,各指標(biāo)基本能恢復(fù)到正常水平。干旱-復(fù)水條件下9個VhTIP基因的表達(dá)量與各生理指標(biāo)相關(guān)性分析表明,在‘花溪-9’葉片中,各生理指標(biāo)與VhTIP1;1、VhTIP1;2、VhTIP2;2、VhTIP4;1和VhTIP5;1基因的表達(dá)量呈正相關(guān),在‘紅地球’葉片中,各生理指標(biāo)與VvTIP1;3和VvTIP2;1的表達(dá)量呈正相關(guān),其中VvTIP2;1達(dá)到顯著正相關(guān),與VvTIP1;1、VvTIP1;4和VvTIP3;1基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。TIP1;2和TIP2;1在2份材料間響應(yīng)干旱逆境的差異最大。6.成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-35S-Vh TIP2;1,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)與花絮浸漬(噴霧)法相結(jié)合將VhTIP2;1成功導(dǎo)入擬南芥,且超量表達(dá)VhTIP2;1基因的T4代擬南芥植株的干旱脅迫耐性遠(yuǎn)高于野生型擬南芥,說明VhTIP2;1基因在野生毛葡萄‘花溪-9’抵御干旱脅迫過程中起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】:貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2017
【分類號】:S663.1
【圖文】:

序列,水通道蛋白,結(jié)構(gòu)模型


基酸序列拓?fù)鋵W(xué)及三維結(jié)構(gòu)分析表明此四聚體結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能行使的正確性具有重要作用(張璐 等,2014)。圖1 水通道蛋白的結(jié)構(gòu)模型Fig. 1 Model of the structure of an AQP引自張璐等(2014)文獻(xiàn)。a 圖中圓柱形代表 - 螺旋(TM1~ TM6),被5個環(huán)(A~ E)所連接。2個螺旋域分別有一半從相對的方向插入細(xì)胞質(zhì)中,構(gòu)成了水通道蛋白的核心。B環(huán)和E環(huán)具有高度保守的NPA殘基。b 圖中紅色部分表示植物水通道蛋白的NPA結(jié)構(gòu)。1.2.1.3 水通道蛋白的分類目前,已在多種植物中分離出水通道蛋白基因。在模式植物擬南芥(Chaumont etal.,2000)、水稻(Johanson et al.,2001)、玉米(Sakurai et al.,2005)、歐洲葡萄(Rebecca et al.,2009)、辣椒(陳儒鋼 等

示意圖,導(dǎo)水率,測定裝置,示意圖


圖 2 導(dǎo)水率測定裝置示意圖2 Schematic diagram of the apparatus for measuring hydraulic condu萄 VhTIPs 基因的表達(dá)模式分析中的表達(dá)模式壤干旱脅迫的‘花溪 9’和‘紅地球’的根、莖、葉的 光定量 PCR 儀,進(jìn)行 VhTIPs 的表達(dá)分析。以葡萄 Ub)作為內(nèi)參,以Ubiquitin-A和Ubiquitin-S(表8)為內(nèi)參引物,反應(yīng)體系為 20 μL。反應(yīng)體系及程序參照 SYBR Plus)試劑盒說明書。表 7 Real-time PCR 反應(yīng)體系Table 7 Real-time PCR reaction systemtion mixture 用量 Consumption 終濃

【參考文獻(xiàn)】

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1 顏培玲;潘學(xué)軍;張文娥;;野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIP1的克隆及其在干旱脅迫下的表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報(bào);2015年02期

2 紀(jì)文龍;范意娟;李辰;魏靈芝;姜金鑄;李冰冰;賈文鎖;;干旱脅迫下葡萄葉片氣孔導(dǎo)度和水勢動態(tài)的變化規(guī)律[J];中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年04期

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4 張璐;杜相革;;植物水孔蛋白研究進(jìn)展[J];植物科學(xué)學(xué)報(bào);2014年03期

5 孫天旭;李玉花;張e

本文編號:2742467


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