【摘要】：柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和柑橘黃龍病菌(Candidatus Liberibacter)是柑橘上兩種重要的植物檢疫性細(xì)菌病害,嚴(yán)重影響了柑橘的種植、生產(chǎn)以及貿(mào)易。由于缺乏有效的防治手段,病害一旦出現(xiàn),如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和有效控制,將導(dǎo)致柑橘果實(shí)早熟脫落、畸形,影響柑橘的口味、產(chǎn)量以及進(jìn)出口,給柑橘的種植造成重大的經(jīng)濟(jì)損失,因此,世界各國都制定了嚴(yán)格的法規(guī)和檢疫措施來防止病害的傳入和蔓延。由于重視程度、農(nóng)藝和管理水平的差異、氣候、環(huán)境條件的影響以及病菌侵染到柑橘發(fā)病的潛伏期不同,導(dǎo)致很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)病原菌侵染并采取有效的排除或者根除措施,防止病害的進(jìn)一步發(fā)展。樣品的高效制備分離方法以及快速、準(zhǔn)確的檢測手段是病原菌篩查以及病害防治的基礎(chǔ)。本研究系統(tǒng)性地建立了基于磁分離技術(shù)的柑橘潰瘍病菌基因組DNA和柑橘基因組DNA納米磁珠分離提取方法、柑橘潰瘍病菌非特異性納米磁珠分離方法以及柑橘潰瘍病菌特異性免疫磁分離方法,同時(shí)建立了后續(xù)的柑橘潰瘍病菌和柑橘黃龍病菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法以及柑橘潰瘍病菌雙抗夾心免疫磁珠檢測方法。本研究同時(shí)采用RNA-seq技術(shù),對田間種植的柑橘甜橙受柑橘黃龍病菌侵染后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。本研究建立的柑橘潰瘍病菌基因組DNA和柑橘基因組DNA納米磁分離方法,3.3×10~8 CFU菌體和100 mg柑橘DNA提取量分別為192.8±11.7μg和89.7±5.2μg,商品化柱式DNA提取純化試劑盒對應(yīng)提取量分別為176.5±3.3μg和118.5±2.2μg,建立的DNA納米磁分離方法與商品化柱式DNA提取純化試劑盒提取量相當(dāng),DNA納米磁分離方法簡便快速,提取效率優(yōu)于商品化柱式DNA提取純化試劑盒。本研究建立的柑橘潰瘍病菌非特異性納米磁分離方法對菌體的平均回收率能夠達(dá)到73%,磁分離菌體的活性不受影響,可直接進(jìn)行涂板培養(yǎng),簡化了菌體的分離培養(yǎng)流程。磁珠對菌體的非特異性結(jié)合受緩沖液pH值的影響,使用pH 8.0 Tris緩沖液作為結(jié)合液,磁珠對菌體的結(jié)合率最高。不同緩沖液中二氧化硅包被磁珠zeta電位測試結(jié)果證實(shí)除包埋作用外,靜電吸附對菌體的非特異性磁分離具有顯著的影響。本研究建立的柑橘潰瘍病菌雙抗夾心免疫磁分離檢測方法具有極強(qiáng)的特異性,對野油菜黃單胞菌野油菜致病型、唐菖蒲伯克霍爾德菌洋蔥致病型、玉米內(nèi)州萎蔫病菌、西瓜細(xì)菌性果斑病菌、玉米細(xì)菌性枯萎病菌以及水稻細(xì)菌性條斑病菌均不會產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。柑橘潰瘍病菌雙抗夾心免疫磁分離檢測方法的靈敏度為3.3×10~5 CFU/mL,與普通ELISA靈敏度相當(dāng)。使用本研究建立的柑橘潰瘍病菌和柑橘黃龍病菌雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法對免疫磁分離菌體進(jìn)行檢測,靈敏度從3.3×10~5 CFU/m L提高到3.3×10~2 CFU/mL,證明本研究建立的免疫磁分離方法具有極高的分離效率。田間種植的柑橘甜橙受柑橘黃龍病菌侵染后RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,相對于健康組柑橘,罹病組柑橘在基因水平共發(fā)現(xiàn)88個(gè)差異表達(dá)基因,其中有57個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),31個(gè)基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平上,罹病組柑橘差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為117,其中,上調(diào)表達(dá)數(shù)量為75,下調(diào)表達(dá)數(shù)量為42。與植物抗病性有關(guān)的差異表達(dá)基因產(chǎn)物包括Endochitinase、Glucan endo-1,3-beta-glucosidase 5、Linoleate 13S-lipoxygenase 2-1、Non-specific lipid-transfer protein、Transcription factor MYB82、Transcription factor MYB1R1、Thaumatin-like protein 1、Systemin receptor SR160、putative disease resistance gene protein(pY14)和plant defensin 2.2(PDF2.2)。與淀粉代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因產(chǎn)物包括Isoamylase 2、Beta-amylase和Glucose-6-phosphate/phosphate translocator 2。其它差異表達(dá)基因產(chǎn)物包括Callose synthase 2、Chlorophyllase-1和Cathepsin等。研究揭示了田間自然環(huán)境中的黃龍病菌侵染柑橘與溫室中人工病原接種柑橘在不同侵染周期的生理、病理差異。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.66
【圖文】：

2 柑橘潰瘍病菌和柑橘黃龍病菌雙重?zé)晒舛?PCR 體系的建立2.3.2 柑橘潰瘍病菌熒光定量 PCR 引物探針擴(kuò)增效率的比較三套柑橘潰瘍病菌熒光定量 PCR 引物探針的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 2.1。xac-f1/r1/p1 引物探針擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3.27461 x+42.99510，r=-0.99844。xac-f2/r2/p2 引物探針擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3.56485 x+45.29504，r=-0.99950。xac-f3/r3/p3 引物探針擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3.26974 x+44.22883，r=-0.99524。三套引物探針的擴(kuò)增效率分別為 102%、91%、102%。

圖 2.2 陽性對照轉(zhuǎn)化菌 PCR 驗(yàn)證Fig. 2.2 Verification of positivetransformed bacterialeft: pMD 18-T/cla-1; right: pMD 18-T/cla-2Lane M: Marker; Lane 1: transformant 1; Lane 2: transformant 2; Lane 3: transformant 3;Lane 4: E.coli JM109; Lane 5: Blank control2.3.4 柑橘黃龍病菌熒光定量 PCR 引物探針擴(kuò)增效率的比較兩套熒光定量 PCR 引物探針的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 2.3。cla-f1/r1/p1 引物探針擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3.17375 x+31.54955，r = -0.99961。cla-f2/r2/p2 引物探針擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3.22559 x+31.65494，r = -0.99983。兩套引物探針的擴(kuò)增效率分別為 105%、104%。

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本文編號：2729919