【摘要】：芥菜(Brassica juncea)是蕓薹屬中重要的蔬菜作物,全國各地都有種植。芥菜從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長需要經(jīng)歷成花轉(zhuǎn)變�；ㄆ诘奶崆盎蜓舆t,會影響生產(chǎn)栽培、品種選育和F1代制種。前期報(bào)道,HDA9去乙�；饔糜贏GL19的組蛋白H3和H4,影響其染色質(zhì)環(huán)境,然后兩者共同影響FT的表達(dá),從而導(dǎo)致花期推遲。但HDA9、AGL19是否可直接調(diào)控核心開花整合子SOC1、AGL24,目前并不清楚。本試驗(yàn)擬克隆芥菜BjuHDA9和BjuAGL19,通過酵母雙雜交、pull-down、酵母單雜交、雙螢光素酶檢測等多種方法,深入研究BjuHDA9和BjuAGL19分別與開花整合子BjuSOC1和BjuAGL24的作用機(jī)制,為芥菜花期分子調(diào)控和“未熟抽薹”調(diào)節(jié)等奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.BjuHDA9和BjuAGL19基因的克隆及生物信息學(xué)分析以芥菜莖尖為試驗(yàn)材料,同源擴(kuò)增得到BjuHDA9和BjuAGL19基因,分別為1284bp和666bp。其中BjuHDA9編碼426個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為48.73kDa,理論等電點(diǎn)為5.26。BjuAGL19編碼221個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為25.16 kDa,理論等電點(diǎn)為8.94。2.BjuHDA9和BjuAGL19基因的表達(dá)模式研究BjuHDA9和BjuAGL19基因在根、莖、葉、花、花蕾五個(gè)組織里均有表達(dá),其中BjuHDA9主要在葉中表達(dá)量較高,在莖中的表達(dá)相對較低;BjuAGL19的表達(dá)主要在根中。短日照條件下,BjuHDA9在各個(gè)組織中的表達(dá)量均有上升;而長日照和春化途徑下,BjuHDA9的表達(dá)量下降。3.BjuHDA9和BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之間的互作分析酵母雙雜交試驗(yàn)表明,BjuSOC1不是BjuHDA9的靶蛋白,而BjuHDA9也不與BjuAGL24蛋白互作。Pull-down試驗(yàn)結(jié)果與酵母雙雜交相一致,進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。4.BjuAGL19與BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之間的互作鑒定酵母雙雜交試驗(yàn)表明,BjuAGL19與BjuSOC1之間不存在相互作用,但BjuAGL24是BjuAGL19的靶蛋白,BjuAGL19可以直接與BjuAGL24相互作用。Pull-down試驗(yàn)結(jié)果與酵母雙雜交結(jié)果相一致,進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。5.BjuHDA9與BjuSOC1、BjuAGL24啟動子互作檢測酵母單雜交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1)×(pGADT7-BjuHDA9)]能夠在SD/-Leu/AbA~(100)固體培養(yǎng)基上正常生長,而Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24)×(p GADT7-BjuHDA9)]能夠在SD/-Leu/AbA~(350)固體培養(yǎng)基上正常生長,說明BjuHDA9蛋白能與BjuSOC1和BjuAGL24啟動子相互作用。雙螢光素酶活性檢測結(jié)果也表明,BjuHDA9蛋白與BjuSOC1和BjuAGL24啟動子在植物體內(nèi)存在互作。進(jìn)一步篩選BjuHDA9蛋白與BjuSOC1、BjuAGL24啟動子的作用區(qū)域。酵母單雜交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1-3)×(pGADT7-BjuHDA9)]能夠在SD/-Leu/AbA~(100)固體培養(yǎng)基上正常生長,同時(shí)Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24-3)×(pGADT7-BjuHDA9)]能夠在SD/-Leu/AbA~(350)固體培養(yǎng)基上正常生長。雙螢光素酶檢測結(jié)果與酵母單雜交結(jié)果相一致,說明BjuHDA9蛋白能與BjuSOC1啟動子截短體片段BjuSOC1-3相互作用,而BjuHDA9蛋白同樣與BjuAGL24啟動子截短體片段BjuAGL24-3能互作。6.BjuAGL19與BjuSOC1、BjuAGL24啟動子互作檢測酵母單雜交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1)×(pGADT7-BjuAGL19)]在SD/-Leu/AbA~(100)固體培養(yǎng)基上不能長出白色菌斑,而Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24)×(pGADT7-BjuAGL19)]同樣在SD/-Leu/AbA~(350)固體培養(yǎng)基上不能長出白色菌斑,說明BjuAGL19蛋白與BjuSOC1和BjuAGL24啟動子之間均不存在相互作用。雙螢光素酶活性檢測結(jié)果也表明,BjuAGL19蛋白與BjuSOC1和BjuAGL24啟動子在植物體內(nèi)沒有相互作用。7.BjuHDA9突變體與BjuSOC1、BjuAGL24啟動子互作檢測試驗(yàn)分別選取芥菜BjuHDA9蛋白的第172、174和261這三個(gè)位點(diǎn),利用重疊延伸PCR對選定的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,分別將這三個(gè)氨基酸置換為丙氨酸,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BjuHDA9突變體仍能與BjuSOC1、BjuAGL24啟動子相互作用,但作用強(qiáng)度減弱。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S637
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文cription activation domain，AD）[91]。 DNA-BD 可特異性結(jié)合上游激活eam activating sequence，UAS）；然后 AD 聚集 RNA 聚合酶 II 復(fù)合物基因的轉(zhuǎn)錄。 DNA-BD 和 AD 分開時(shí)仍各具功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄通過適當(dāng)一定的途徑在空間上相互接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因活上游序列的啟動子，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[92]�；谶@一特性，將兩個(gè)與 DNA-BD 和 AD 結(jié)構(gòu)域融合，形成的融合蛋白分別稱為 bait ，或已知蛋白、Y 蛋白）和 prey 蛋白（即獵物，或靶蛋白、X 蛋白）個(gè)待測蛋白之間能夠相互作用，它們便能夠重新具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性序列的啟動，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[94]（圖 1-1）。

第 1 章 文獻(xiàn)綜述-DNA 互作的研究方法胞生命活動中，許多的活動均涉及到 DNA 與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問發(fā)展出了一系列研究 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法，如酵母單雜交實(shí)驗(yàn)（id system，Y1H）、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMS疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）等。母單雜交系統(tǒng)單雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system，Y1H）是由酵母雙雜交系統(tǒng)（id system，Y2H）衍化而來[97]。其基本原理是：通過將轉(zhuǎn)錄激活因子 GA合結(jié)構(gòu)域置換為特定蛋白（prey protein）的編碼基因，其編碼的蛋白能與目）相互作用來激活 RNA 聚合酶 polII，啟動下游的報(bào)告基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[98]。檢測下游基因是否表達(dá)，就能夠驗(yàn)證目的基因和蛋白之間是否存在相互作）。

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1 王宇;蔣煒;閆凱;周雯文;王志敏;魏大勇;湯青林;;青花菜AGL18及HDA9與開花信號整合子互作研究[J];園藝學(xué)報(bào);2018年12期

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1 蔣煒;芥菜HDA9和AGL19克隆、表達(dá)及其與核心開花整合子的作用機(jī)制研究[D];西南大學(xué);2018年

本文編號：2722758