【摘要】：近幾年,蘋(píng)果一種重要的新病害——蘋(píng)果炭疽葉枯病(Glomerella leaf spot of apple),在我國(guó)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)連年大發(fā)生,給蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨額損失。目前,關(guān)于該病害的研究主要集中在病原學(xué)、病害發(fā)生規(guī)律和防治方法,而關(guān)于病原菌致病的分子基礎(chǔ)研究較少。本研究開(kāi)展了蘋(píng)果炭疽葉枯病菌致病機(jī)理研究,旨為該病害防治的新途徑、新方法提供線(xiàn)索。本研究首先對(duì)T-DNA插入突變體庫(kù)中的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀測(cè),獲得與野生型菌株培養(yǎng)性狀差異較大的菌株7株。其中突變體M22和M178的產(chǎn)孢量為野生型的10倍,突變體M17和M44失去了產(chǎn)孢能力,其他3株突變體的產(chǎn)孢量約為野生型的1%。致病力測(cè)定結(jié)果表明,7株突變體的致病能力均有下降,其中M44和M285完全失去了致病能力。Southern blot分析結(jié)果顯示,7株突變體基因組中的T-DNA均是單拷貝插入。為分離因T-DNA插入受到影響的基因,本研究運(yùn)用hiTail-PCR技術(shù),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,獲得了T-DNA插入點(diǎn)的右翼序列,經(jīng)與圍小從殼菌菌株23基因組比對(duì)分析,獲知突變體可能受到影響的基因分別為GcRRN3,GcRXT2,GcGD1,GcCON3,GcOPT2,GcMRP1和GcVIR1。為進(jìn)一步鑒定候選基因,本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)7個(gè)候選基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了檢測(cè),7個(gè)基因在野生型菌株W16中均能擴(kuò)增出單一條帶,然而在各自突變體中無(wú)條帶出現(xiàn),表明7個(gè)候選基因在各自突變體中轉(zhuǎn)錄受到抑制。本研究其次對(duì)GcVIR1基因進(jìn)行了深入分析。該基因全長(zhǎng)1686 bp,不含有內(nèi)含子,編碼562個(gè)氨基酸。為進(jìn)一步明確GcVIR1基因的功能,本研究構(gòu)建了GcVIR1基因恢復(fù)載體,并借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)成功將GcVIR1基因轉(zhuǎn)入GcVIR1突變體M285基因組中,獲得了GcVIR1基因恢復(fù)菌株R-GcVIR1。表型測(cè)定結(jié)果顯示,恢復(fù)菌株R-GcVIR1完全恢復(fù)了GcVIR1突變體M285的表型缺陷。為了確定GcVIR1蛋白的亞細(xì)胞定位,我們構(gòu)建了GcVIR1-RFP融合表達(dá)的GcVIR1恢復(fù)菌株R-VIR1RFP。熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果表明,GcVIR1分布于細(xì)胞質(zhì)中。為明確GcVIR1在該菌中的時(shí)空表達(dá)模式,本研究利用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了GcVIR1在菌絲、分生孢子、芽管和附著胞的表達(dá)量,結(jié)果顯示,GcVIR1在蘋(píng)果炭疽葉枯病菌各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá),在分生孢子中相對(duì)表達(dá)量最高。膠胞炭疽菌通過(guò)分泌果膠酶(聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和果膠酸酯裂解酶),克服寄主細(xì)胞壁中的果膠,使其成功在寄主體內(nèi)定殖。在本研究中,GcVIR1突變體失去了致病能力,因此我們利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了果膠酶合成相關(guān)基因PG1、PG2、pnl-1、pnl-2和pelB在突變體M285中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,PG1基因表達(dá)量升高至5.89倍,PG2基因表達(dá)量升高至4.58倍,其他3個(gè)基因與野生型菌株無(wú)差異。表明GcVIR1負(fù)調(diào)控PG1和PG2基因的表達(dá)。在膠孢炭疽菌中,由附著胞調(diào)節(jié)的侵入方式在其致病過(guò)程中起到重要作用,而絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑中相關(guān)基因CMK1、CPK1、MEK1和MAF1被證實(shí)在這一過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。考慮到GcVIR1突變體失去了產(chǎn)生附著胞的能力,本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了這些基因在突變體M285中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,CMK1、CPK1、MEK1和MAF1在突變體M285中表達(dá)量(與野生型相比)無(wú)明顯變化,因此,推測(cè)GcVIR1基因在功能上可能位于CMK1、CPK1、MEK1和MAF1基因的下游。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S436.611.1
【圖文】：

然 cst1 基因是 CMK1 下游的潛在功能基因，但 CST1 功能還有待于更加深入的研究。另一個(gè) MAPK 蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路基因 MAF1 與釀酒酵母 Mpk1 基因同源(Kojima et al.,2002)。盡管 MAF1 基因突變菌株生長(zhǎng)形態(tài)正常，但其致病力是明顯減低的。MAF1 基因突變菌株產(chǎn)生細(xì)長(zhǎng)的分生孢子，分生孢子在寄主表面及載玻片上均不能夠形成附著胞，說(shuō)明 MAF1 基因在附著胞形成過(guò)程中發(fā)揮重要功能(Hiruma et al., 2010)。與 MAF1 突變體不同的是，cmk1 突變體不能形成正常的附著胞，但能形成膨大的附著胞類(lèi)似結(jié)構(gòu)。因此，MAF1 在附著胞早期分化過(guò)程中發(fā)揮重要功能，而 cmk1 在附著胞成熟過(guò)程中發(fā)揮重要功能。雖然 CMK1 和 MAF1 基因參與炭疽菌致病性，但是另一個(gè)MAPK蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑基因OSC1被證實(shí)是致病性非必需的(Kojimaet al., 2004)。OSC1 敲出突變體對(duì)高滲透壓敏感，并且增強(qiáng)了抗藥性，說(shuō)明 OSC1 基因參與對(duì)滲透壓及農(nóng)藥敏感性的應(yīng)答反應(yīng)。與 MAPK 蛋白激酶信號(hào)通路類(lèi)似，cAMP 信號(hào)通路也參與孢子萌發(fā)及侵染相關(guān)形態(tài)建成過(guò)程(Takano et al., 2001)。蛋白激酶 A(PKA)催化亞基基因 CPK1 和腺苷酸環(huán)化酶基因 CAC1 是炭疽菌致病性必需的(Yamauchi et al., 2004)，并且 CPK1 和 CAC1 基因缺失突變體孢子萌發(fā)受阻，這一結(jié)果揭示這 cAMP 信號(hào)途徑參與孢子萌發(fā)過(guò)程的調(diào)控。此外，CPK1 和 CAC1 突變體在寄主內(nèi)的侵染生長(zhǎng)是有缺陷的。相反，RPK1 突變體的孢子萌發(fā)及侵染生長(zhǎng)不受影響。以上結(jié)果說(shuō)明 cAMP蛋白激酶信號(hào)通路是炭疽菌孢子萌發(fā)及侵染生長(zhǎng)所必需的。

生型菌株 W16 和突變體分別接種在 PDA 培養(yǎng)基上，25°C 黑暗培養(yǎng) 8 d 后觀察菌圖 2.1）顯示：與野生型菌株 W16 相比，7 個(gè)突變體出現(xiàn)不同程度的白化且菌絲稀NA 的插入影響了 7 個(gè)突變體的菌落形態(tài)。 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 8 d 后，調(diào)查突變體及野生型菌株的菌落直徑，由表 2.1 可以看株菌落直徑達(dá)到 8.5 cm，突變體生長(zhǎng)速度均有不同程度的下降，M44 和 M163 菌落，分別為 7.5 cm、7.6 cm；M17、M22、M178、M183 和 M285 生長(zhǎng)速度下降明顯別為 4.8 cm、4.4 cm、5.8 cm、6.7 cm、3.5 cm。突變體產(chǎn)孢量的分析結(jié)果表明，野生型菌株每皿能夠產(chǎn)生5×106個(gè)分生孢子；M22產(chǎn)孢量明顯增加，產(chǎn)孢量分別為 3.6×107/皿、5.8×107/皿；其余菌株的產(chǎn)孢量明的產(chǎn)孢量為 5.0×104/皿，M163 產(chǎn)生 2.3×104/皿，M17、M44 和 M183 喪失了產(chǎn)孢了檢測(cè) T-DNA 標(biāo)簽插入對(duì)突變體致病力影響，本研究采用離體葉片接種孢子懸浮菌株 W16 及 7 個(gè)突變體進(jìn)行了致病力分析。由表 2.1 可以看出，與野生型菌株相比病力均有不同程度的降低。W16(對(duì)照菌株)在接種葉片 3d 后，在葉片上形成直徑為，突變體 M178 致病力少稍有下降，形成的病斑直徑大小為 0.94 cm；突變體 M17、和 M183 致病力下降明顯，病斑直徑分別為 0.50 cm、0.32 cm、0.34 cm、0.12 cm； M285 對(duì)葉片均喪失了致病能力，未形成病斑。

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳建圓;王娜;冀志蕊;遲福梅;周宗山;張俊祥;;蘋(píng)果炭疽葉枯病菌致病力分析及蘋(píng)果種質(zhì)抗病性鑒定[J];植物遺傳資源學(xué)報(bào);2017年02期

2 董冰;李亮;王燕平;趙學(xué)勇;王文平;;淺談蘋(píng)果炭疽葉枯病的發(fā)生與防治[J];湖北植保;2015年02期

3 王薇;符丹丹;張榮;孫廣宇;;蘋(píng)果炭疽葉枯病病原學(xué)研究[J];菌物學(xué)報(bào);2015年01期

4 孫芳娟;查養(yǎng)良;李保華;高登濤;胡曉望;;陜西咸陽(yáng)蘋(píng)果炭疽葉枯病的發(fā)生與防控[J];中國(guó)果樹(shù);2015年01期

5 張俊祥;吳建圓;冀志蕊;遲福梅;蔣曉玲;董慶龍;周宗山;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋(píng)果炭疽葉枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化及插入突變體的篩選[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2014年06期

6 王冰;王彩霞;史祥鵬;張振芳;李保華;;不同殺菌劑對(duì)蘋(píng)果炭疽葉枯病的防治效果[J];植物保護(hù);2014年06期

7 王春明;高洪岐;仉服春;李志鵬;董玉軍;;蘋(píng)果炭疽葉枯病在綏中的發(fā)生與防治[J];北方果樹(shù);2014年06期

8 任斌;高小寧;韓青梅;黃麗麗;;蘋(píng)果炭疽葉枯病病原Glomerella cingulata及其侵染過(guò)程[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2014年05期

9 王志龍;郭鵬亮;;蘋(píng)果炭疽葉枯病發(fā)生規(guī)律與防治辦法[J];西北園藝(果樹(shù));2014年05期

10 洛曉平;符麗珍;;蘋(píng)果炭疽葉枯病的發(fā)生與防治[J];煙臺(tái)果樹(shù);2014年03期

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1 孫虎;柿樹(shù)炭疽菌基因組文庫(kù)構(gòu)建及致病性相關(guān)突變體的篩選分析[D];浙江大學(xué);2008年

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2 張麗麗;柿樹(shù)炭疽菌突變體致病性及相關(guān)基因的克隆[D];浙江大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2721303