【摘要】：葉片是植物的重要源器官,在植物的光合、呼吸和光感受中必不可少。葉片形態(tài)是植株形態(tài)建成的組成部分,葉形是“理想株型”的重要構(gòu)成要素,對(duì)于植株生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)非常重要。挖掘和克隆葉形控制基因,對(duì)于揭示植物葉形的調(diào)控機(jī)理和加快作物的株型育種進(jìn)程具有重要意義。目前已在其它植物上克隆了多個(gè)葉形控制基因,但在葫蘆科作物上,對(duì)葉形控制基因的挖掘很少見報(bào)道。課題組從黃瓜(Cucumis sativus L.)自交系CCMC的EMS突變體庫(kù)中,鑒定了2個(gè)圓葉突變體C356和C949,本研究以此為材料,采用圖位克隆并結(jié)合MutMap的方法,對(duì)黃瓜圓葉基因Csrl-1和Csrl-2進(jìn)行克隆,并對(duì)候選基因進(jìn)行了初步的功能分析。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究黃瓜葉形調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.黃瓜圓葉突變體表型及其遺傳分析對(duì)突變體C356和C949的表型進(jìn)行了觀察,結(jié)果表明,與野生型相比,兩個(gè)突變體均表現(xiàn)為葉形為圓形,葉緣相對(duì)光滑,花萼片缺失或減少,雌花的花瓣頂端閉合成棒狀。與突變體C356的植株相比,突變體C949的植株相對(duì)較低。對(duì)突變體的圓葉性狀進(jìn)行的田間調(diào)查結(jié)果表明,兩個(gè)突變體的F_1均呈現(xiàn)正常葉形。在F_(2:3)群體中,正常葉形植株與圓形葉植株的分離比經(jīng)卡方檢驗(yàn)均符合3:1的性狀分離比例,此結(jié)果表明C356和C949的圓葉性狀分別是由隱性單基因Csrl-1和Csrl-2所控制的質(zhì)量性狀。2.黃瓜圓葉突變體基因Csrl的克隆及鑒定對(duì)調(diào)控C356和C949圓葉性狀的Csrl-1和Csrl-2基因分別進(jìn)行了精細(xì)定位。用1196株F_2分離群體,和18對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記及新開發(fā)的dCAPS標(biāo)記,通過遺傳作圖將Csrl-1基因定位在黃瓜Chr1的188.9kb的區(qū)域內(nèi)。MutMap分析結(jié)果表明,在Csrl-1定位區(qū)間內(nèi),只有一個(gè)位于CsPID1基因中的非同義SNP1G19389180符合其過濾標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合Csrl-1定位區(qū)間內(nèi)的基因及MutMap分析結(jié)果,CsPID1基因是Csrl-1最可能的候選基因。對(duì)Csrl-1候選基因CsPID1進(jìn)行了克隆,序列比對(duì)結(jié)果表明,在C356的CsPID1基因CDS區(qū)發(fā)生了C~(1000)到T~(1000)的堿基突變,導(dǎo)致野生型的Pro~(334)置換為C356中的Ser~(334)。利用該非同義突變的SNP開發(fā)的dCAPS標(biāo)記NWdCAPS360在大群體中進(jìn)行了連鎖分析驗(yàn)證,結(jié)果表明,該標(biāo)記與交換單株共分離;為了檢測(cè)該SNP位點(diǎn)是否在自然種質(zhì)中存在,利用該標(biāo)記對(duì)100份黃瓜自然種質(zhì)進(jìn)行了位點(diǎn)唯一性檢測(cè),結(jié)果表明,該SNP位點(diǎn)只存在于突變體中。利用與Csrl-1相同的SSR分子標(biāo)記,將Csrl-2基因也定位于188.9kb區(qū)域內(nèi)且是相同的候選基因CsPID1,利用MutMap的方法,也發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)位于CsPID-1基因中的非同義SNP1G19389177符合其過濾標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合Csrl-2定位區(qū)間內(nèi)的基因及MutMap的分析結(jié)果,CsPID1基因是Csrl-2最可能的候選基因。對(duì)突變體C949和野生型CCMC的Csrl-2候選基因CsPID1進(jìn)行克隆,序列比對(duì)結(jié)果表明,C949在CsPID1基因CDS區(qū)1003 bp位點(diǎn)處發(fā)生了G到A的堿基突變,導(dǎo)致野生型中的Glu~(335)置換為C949中的Lys~(335)。C356和C949的候選基因均為CsPID1,但是在兩個(gè)突變體中該基因的突變位點(diǎn)不同。對(duì)這兩個(gè)突變體進(jìn)行了等位性檢測(cè),結(jié)果顯示雜交后代中正常葉植株與圓形葉植株的分離比均符合3:1的性狀分離比例。Csrl-2是Csrl-1的等位基因。3.CsPID1基因功能的初步分析通過qPCR檢測(cè)CsPID1在CCMC和C356不同組織器官的表達(dá)。結(jié)果表明與野生型相比,CsPID1基因在C356的根、葉和雌花中表達(dá)量顯著降低。這可能與導(dǎo)致rl-1突變體中較不發(fā)達(dá)的根,圓葉和異常的雌花器官有關(guān)。CsPID1編碼Ser/Thr蛋白激酶,參與生長(zhǎng)素輸?shù)臉O性運(yùn)輸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在黃瓜基因組中有3個(gè)同源基因:CsPID1,CsPID2和CSPID2L(CsPID2-like),而CsPID1基因在野生型和C356的葉片中的表達(dá)有顯著差異,表明CsPID1基因在圓葉形成過程中可能起主要作用。同時(shí)將35S-CsPID1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)與過表達(dá)擬南芥AtPID基因部分相似的表型,這一結(jié)果也支持CsPID1為候選基因。4.突變體雌不育現(xiàn)象通過解剖學(xué)觀察、花粉活力鑒定、正反交測(cè)試、熒光電鏡掃描及qPCR分析等一系列的分析,發(fā)現(xiàn)突變體植株花粉粒的育性正常,利用雄花作為父本授粉均能正常結(jié)實(shí)產(chǎn)生種子,表明了突變體果實(shí)無種子可能是由于雌性不育導(dǎo)致,進(jìn)一步研究表明,突變體的雌性不育是由于突變體內(nèi)沒有胚珠不能完成受精所致。CsPID1基因功能的喪失可能對(duì)生長(zhǎng)素的流出造成干擾,導(dǎo)致黃瓜子房胎座形成初期以及胚珠原基生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)素最大值的形成失敗或延遲,最終導(dǎo)致不能形成胚珠。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S642.2
【圖文】：

第二章 突變體基因 Csrl 的圖位克隆和初步功能分析.3 結(jié)果與分析3.1 C356 和 C949 圓葉突變體表型觀察分析3.1.1 C356 圓葉突變體表型觀察分析圓葉突變體 C356 部分植株子葉發(fā)育異常，呈現(xiàn) 3 子葉或者子葉扭曲分裂等表葉呈圓形，葉緣光滑，幼苗期開始到成熟期其性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。就葉形特征來說，T（CCMC）相比，突變體 C356 是具有相對(duì)平滑邊緣的圓葉表型（圖 2-1；圖 2-2A子葉階段，一些突變植物表現(xiàn)出多子葉或子葉的非對(duì)稱發(fā)育（圖 2-1D）。而且在體中葉片的葉緣光滑，葉緣鋸齒數(shù)目相對(duì)較少（圖 2-2B）。

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文圖 2-2 野生型和突變體葉緣鋸齒的掃描葉片圖像（A）和每片葉片上葉緣鋸齒的平均數(shù)（B）（**表示 P<0.01）Fig. 2-2 Scanned leaf images of CCMC and C356 (a) showing serration of leaf margins and mean numberof serrated teeth on each leaf (b), respectively (**P<0.01)2.3.1.2 C949 圓葉突變體表型觀察分析圓葉突變體 C949 同樣是部分突變體的植株子葉發(fā)育異常，幼苗期至成熟期，均能觀察到突變體與野生型葉片形態(tài)的表型差異（圖 2-3）。與突變體 C356 相比，突變體C949 的植株相對(duì)較低。與 WT（CCMC）相比，突變體 C949 的子葉也是多子葉或非對(duì)稱發(fā)育（圖 2-3D）。

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1 周航;王京文;徐文;;設(shè)施黃瓜施用鉀肥效果試驗(yàn)[J];杭州農(nóng)業(yè)科技;2007年01期

2 孫健;李W

本文編號(hào)：2719397