發(fā)布時間：2020-06-16 06:13

【摘要】：梨是我國主栽果樹之一,果實含有種類豐富的類黃酮類化合物。其中一些如花青苷類化合物是影響梨果實紅色著色的關(guān)鍵色素,另一些其他水果不具備的特有類黃酮組分,如異鼠李素糖苷等化合物則具有潛在藥用或保健價值的組分�！t早酥’梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)是本研究所在的課題組于2004年發(fā)現(xiàn)的‘早酥’梨的富類黃酮芽變,在2013年通過了省級品種審定。前期研究表明,‘紅早酥’梨除了花青苷合成與著色模式與‘早酥’差異較大外,其整個類黃酮代謝,特別是黃酮醇代謝支路也發(fā)生了顯著的改變。因此,本研究主要以‘紅早酥’梨為材料,研究了其果實類黃酮代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),鑒定出對突變性狀有貢獻的關(guān)鍵基因PbGA2ox8。主要研究結(jié)果如下:1.篩選出與梨果實類黃酮積累相關(guān),可能參與調(diào)控類黃酮合成的4個R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子:PbMYB10,PbMYB10b,PbMYB9和PbMYB3。PbMYB10和PbMYB10b,PbMYB9以及與PbMYB3的表達模式與多數(shù)類黃酮合成結(jié)構(gòu)基因的表達模式具有較高的相關(guān)性,同時其在‘早酥’與‘紅早酥’梨中的差異表達模式也與相關(guān)的類黃酮組分積累水平一致。由于PbMYB10功能已知,因此本研究下一步重點關(guān)注了PbMYB10b,PbMYB9和PbMYB3的功能。進一步的研究表明,PbMYB10b不僅正向調(diào)控梨果實中花青苷的合成,同時通過上調(diào)結(jié)構(gòu)基因PbDFR的表達影響了原花青素的合成。同時PbMYB9不僅正向調(diào)控梨果實原花青素的合成,同時通過上調(diào)結(jié)構(gòu)基因PbUFGT1表達影響了花青苷與黃酮醇類物質(zhì)的合成,且PbMYB9的功能不能被其他基因完全互補,表明PbMYB9是梨類黃酮調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。2.維管束依賴型的花青苷積累與分布造成了‘紅早酥’紅色條紋果實與紅色葉脈葉片,這是‘紅早酥’區(qū)別于其他常見紅色梨品種的重要突變性狀本研究系統(tǒng)對比觀察了‘紅早酥’與‘早酥’花、葉和果等不同組織的著色模式。歸納總結(jié)出‘紅早酥’區(qū)別于其他常見紅色梨品種的特殊著色規(guī)律:除紅色條紋狀的果實外,‘紅早酥’的其他器官如花器官,葉片以及幼芽等也同樣具備紅色外觀,這些不同器官的紅色著色模式具備一個共同點,即紅色著色區(qū)域不均勻且與維管束的分布相一致;‘紅早酥’果實著色模式的另一個特點在于其果點周圍同樣是紅色富集的區(qū)域。3.通過對‘早酥’與‘紅早酥’幼葉,成熟葉和幼果的差異轉(zhuǎn)錄組比較分析,鑒定出26個與紅早酥突變性狀高度相關(guān)的候選基因本研究選擇了突變體‘紅早酥’中具有維管束依賴型著色模式的三種典型組織(幼葉,成熟葉和幼果)與對應(yīng)母株‘早酥’的相同器官為材料,通過對比分析其轉(zhuǎn)錄本的差異,獲得了在表達水平上與該突變性狀相關(guān)的26個候選基因。在這26個候選基因中,包含了一個依賴于HY5,由PAP(Production of anthocyanin pigment)類MYB轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)由FLS和UFGT催化控制的較為完整的類黃酮合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò),同時也篩選出了HY5下游光響應(yīng)基因ELIP,矮化相關(guān)基因XND1,ABA調(diào)控氣孔開閉過程相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白ABCG40以及與矮化,環(huán)境響應(yīng)型花青苷積累和植物光形態(tài)建成密切相關(guān)的赤霉素氧化酶。這些結(jié)果首先明確了‘紅早酥’中類黃酮合成的大部分調(diào)控途徑,同時篩選出的其他基因為進一步發(fā)掘‘紅早酥’其他突變性狀提供了方向,最后為定位‘紅早酥’一系列突變性狀的突變位點,解析‘紅早酥’最終的突變機理,在轉(zhuǎn)錄層面提供了一個較為清晰的范圍。4.鑒定出與突變緊密連鎖的相關(guān)基因PbGA2ox8,并在‘紅早酥’PbGA2ox8啟動子部分檢測到去甲基化現(xiàn)象我們檢測了之前篩選出的26個表達模式與突變相關(guān)的候選基因在‘紅早酥’紅色/綠色雜交后代中的表達,根據(jù)表達水平與突變性狀(花青苷含量)的相關(guān)性,從中篩選出13個與突變性狀連鎖表達的基因。進一步根據(jù)這13個基因在基因組臨近的SSR標記,我們發(fā)現(xiàn)其中只有相鄰PbGA2ox8基因的SSR標記的分離模式與突變性狀緊密連鎖。本研究進一步利用Genome walking技術(shù)克隆了PbGA2ox8的啟動子,相較于母株‘早酥’,其啟動子區(qū)域也發(fā)生了明顯的去甲基化現(xiàn)象,這符合該基因在紅早酥各組織中的超表達現(xiàn)象。5.PbGA2ox8能夠在鈣離子富集的維管束區(qū)域正向調(diào)控梨果實和葉片中花青苷的合成,為研究PbGA2ox8是否能夠誘導(dǎo)維管束依賴型的花青苷積累,本研究分別在‘早酥’梨幼果和幼葉中,利用瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)超表達了PbGA2ox8。轉(zhuǎn)化結(jié)果表明,PbGA2ox8能夠在這兩種組織中誘導(dǎo)花青苷的合成,同時在過表達PbGA2ox8的組織中也檢測到花青苷正調(diào)控或合成基因PbMYB10,PbUFGT1和PbGSTF12的上調(diào)。特別在過表達PbGA2ox8的‘早酥’梨幼葉中,花青苷大量富集在維管束(葉脈)的周圍,形成了維管束依賴型的紅色著色類型。同時,當‘紅早酥’果實中的鈣信號被其拮抗劑氯化鑭阻遏時,‘紅早酥’梨果實不能正常積累花青苷,這表明‘紅早酥’果實中花青苷合成積累過程依賴于鈣信號。同時在過表達PbGA2ox8的‘早酥’梨幼葉中,當鈣信號被氯化鑭阻遏時,同樣不能形成維管束依賴型的花青苷積累模式。這些結(jié)果表明,PbGA2ox8誘導(dǎo)的花青苷積累主要發(fā)生在鈣元素富集的區(qū)域并最終在果實表面形成了和維管束對應(yīng)的縱向條紋。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S661.2
【圖文】：

種物前黃酮組分。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異，類黃酮類次生醇（flavonols），花青苷（anthocyanins），異aurones）類化合物和鞣酐（phlobaphenes）圖 1-1 類黃酮的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1-1 C6-C3-C6 structure of flavonoids

1.3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的類黃酮代謝圖 1-2 梨果實中的類黃酮組分與合成路徑（Zhai et al. 2014）Figure 1-2 Flavonoid compounds and biosynthesis pathways in pear

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