【摘要】：梅(Prunus mume)品種繁多,花姿豐富。由于受北方冬季低溫的限制,大多數(shù)品種不能露地過冬,因此培育出抗寒性更強(qiáng)的梅花,有極其重要的園林應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。鋅指蛋白是一類通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來影響植物的生長發(fā)育和應(yīng)答低溫脅迫,具有“手指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。本研究基于‘雪梅’葉片4℃低溫處理下的基因表達(dá)譜和梅花基因組數(shù)據(jù),克隆了梅花5個(gè)C2H2型和1個(gè)BBX型鋅指蛋白基因,分析6個(gè)目的基因在低溫脅迫下的表達(dá)變化,構(gòu)建6個(gè)超量表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)化擬南芥,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的低溫脅迫處理,初步確定其抗寒性功能,并對(duì)超表PmBBX32基因擬南芥進(jìn)行了相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定和基因表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:1、從‘雪梅’葉片克隆5個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因(PmZAT9、PmZAT10A、PmZAT10B、PmZAT11、和PmZAT12)和1個(gè)BBX型鋅指蛋白基因(PmBBX32)并進(jìn)行低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果表明,這6個(gè)目的基因?qū)Φ蜏卣T導(dǎo)都有不同程度的響應(yīng)。在C2H2型鋅指蛋白基因中PmZAT12和PmZAT10A對(duì)低溫誘導(dǎo)的響應(yīng)比另外3個(gè)基因(PmZAT9、PmZAT10B和PmZAT11)強(qiáng)烈;BBX型鋅指蛋白基因PmBBX32對(duì)低溫誘導(dǎo)有微弱響應(yīng)。2、構(gòu)建6個(gè)目的基因的超量表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化擬南芥。得到了轉(zhuǎn)PmZAT9、PmZAT12和PmBBX32基因的T_3代純合株系,轉(zhuǎn)PmZAT10A基因的T_2代單拷貝株系,轉(zhuǎn)PmZAT10B和PmZAT11 T_1代陽性苗。3、轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫抗性鑒定。與野生型相比,低溫處理下超表PmZAT12基因的擬南芥株系存活率降低,超表PmBBX32基因的株系存活率提高,而PmZAT9和PmZAT10A的超表株系的存活率與野生型相比并無顯著差異。4、轉(zhuǎn)PmBBX32基因擬南芥生理指標(biāo)檢測(cè)和基因表達(dá)分析。與野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)PmBBX32基因擬南芥具有更低的相對(duì)電導(dǎo)率和ROS積累量,以及更高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量,說明PmBBX32基因的超表降低了低溫對(duì)植株的傷害,同時(shí)可能通過提高抗氧化酶活性和脯氨酸的含量增強(qiáng)了植株的抗寒性。此外RT-PCR結(jié)果表明超表PmBBX32可以上調(diào)冷脅迫和SOD相關(guān)基因的表達(dá),從而提高植株的抗寒性。5、超表PmZAT12和PmBBX32擬南芥開花表型分析。形態(tài)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,超表PmZAT12和PmBBX32擬南芥的開花時(shí)間明顯晚于野生型,并且均具有矮化特征。并且轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時(shí)蓮座葉葉片數(shù)量與野生型相比顯著增多,推測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型可能是與植物本身的發(fā)育緩慢有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S685.17
【圖文】：

8 數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為 3 次及以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的均值。利用 IBM SPSS Statistics 1對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并在P<0.05或P<0.01水平做Duncan’s Mutiple Rangts，作圖采用 SigmaPlot 10.0 和 Excel 2010 軟件。結(jié)果與分析1 目的基因的克隆和同源蛋白序列分析根據(jù)‘雪梅’葉片在 4℃低溫處理下的基因表達(dá)譜和梅花基因組數(shù)據(jù)，篩選出H2 型鋅指蛋白的 5 個(gè)基因（Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm17805 和021284）和 BBX 型鋅指蛋白 Pm013051 作為目的基因。以‘雪梅’葉片的 cDNA 為，根據(jù)從梅花基因組中下載目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增如圖 1。序列分析果表明，Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm013051、Pm017805、Pm02128完整的開放閱讀框區(qū)域，長度分別為 537bp、555bp、795bp、795bp、1191bp 和bp，編碼氨基酸數(shù)分別為 179、185、275、275、397 和 242 個(gè)。A B

20圖 2 目的基因蛋白與其它物種同源蛋白序列比對(duì)（A） Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm017805、Pm021284 蛋白與李屬和擬南芥同源蛋白序列比對(duì)（B） Pm013051 蛋白與其它物種同源蛋白序列比對(duì)。Fig. 2 Sequence alignment of the target gene protein with the homologous proteins of otherspecies(A) Sequence alignment of Pm000815, Pm002762, Pm005390, Pm017805 and Pm021284 protein with the homologousproteins of Prunus and Arabidopsis thaliana (B) Sequence alignment of Pm013051 protein with the homologousproteins of other species.

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本文編號(hào)：2715069