【摘要】：果生刺盤孢(Colletotrichum fructicola)是蘋果炭疽葉枯病(Glomerella leaf spot)的主要病原。蘋果炭疽葉枯病是近幾年我國蘋果生產(chǎn)中出現(xiàn)的流行性很強(qiáng)的病害,危害葉片和果實,引起葉斑、葉片干枯脫落、采前大量落果等癥狀,對蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)威脅很大,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了能在各種復(fù)雜的pH條件下生存,真菌形成適應(yīng)外部pH值的機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子PacC在真菌pH信號通路中處于核心位置,也是很多真菌的毒力因子。該因子在不同pH下激活或者抑制一些基因的轉(zhuǎn)錄。由于在幼果期果實酸度較高,苦腐病侵染果實后處于潛伏侵染狀態(tài),而果生刺盤孢在幼果期能夠引起典型斑點(diǎn)癥狀,這種特性是否與其對pH的適應(yīng)或調(diào)節(jié)能力有關(guān),目前還不清楚。本研究針對果生刺盤孢利用基因敲除策略,開展了PacC基因與生長、產(chǎn)孢、致病及pH適應(yīng)性關(guān)系研究,以期為該菌的致病機(jī)制及進(jìn)一步的防治提供理論依據(jù),取得以下主要結(jié)果。1)本研究采用split PCR技術(shù)構(gòu)建了含有潮霉素(hph)的基因敲除盒,通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,獲得了抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子,利用PCR檢測,鑒定出4個PacC的敲除突變體。2)對突變體與野生型在生物學(xué)特性和致病力上差異進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在PDA上突變體生長速率明顯下降,分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率明顯下降,說明該基因?qū)ζ浞稚咦用劝l(fā)、附著胞形成和生長速率具有較大影響。對嘎拉葉片進(jìn)行有傷和無傷接種,結(jié)果均顯示突變體病斑面積要顯著小于野生型,說明PacC基因影響果生刺盤孢侵入葉片和菌絲在葉片中的擴(kuò)展。對嘎拉果實進(jìn)行無傷接種,結(jié)果顯示突變體不發(fā)病野生型發(fā)病,說明PacC基因影響果生刺盤孢侵入果實。有傷接種結(jié)果顯示突變體和野生型差異不顯著,有待進(jìn)一步研究菌絲在蘋果組織中的擴(kuò)展。接種結(jié)果表明PacC基因影響果生刺盤孢致病力。通過構(gòu)建互補(bǔ)載體,獲得PacC的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子,G418和PCR檢測出陽性互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子,對其進(jìn)行上述表型觀察和致病力檢測。發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子在菌落形態(tài)和生長速率、孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和對嘎拉葉片的致病力均能恢復(fù)到野生型狀態(tài),表明敲除突變體的生物學(xué)變化和致病力變化確實是由于PacC基因的缺失引起。3)在不同pH的培養(yǎng)基培養(yǎng),結(jié)果顯示在pH3時,突變體和野生型生長差異不顯著,在pH4至pH6,突變體比野生型生長速率顯著變慢,且隨著pH增加,突變體與野生型生長速率差值越來越大,表明PacC在酸性條件下可以促進(jìn)果生刺盤孢的生長;在pH8培養(yǎng)基上,突變體菌落生長明顯變慢;在pH9時,突變體不能生長,而野生型雖受到抑制,仍能緩慢生長,表明Pac C在堿性條件下也影響果生炭疽菌的生長,在較高pH條件下為該菌生長所必需。綜上所述,PacC基因影響果生炭疽菌生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成及致病力。在酸堿性條件下,該基因均與果生炭疽菌的生長有關(guān)。
【圖文】：

得到 PacC27，，為活性形式，在堿性 pH 下抑制酸性表達(dá)基因并激活堿性基因的表 PacC 本身（圖 1-1）（Caracuel et al. 2003a, 2003b; Espeso andArst 2000; Mingot9; Orejas et al. 1995）。在酸性環(huán)境下，PacC 在細(xì)胞質(zhì)中，不進(jìn)行蛋白水解，但 信號，Pal 裝置激活 PacC。其活性形式被移到細(xì)胞核，特異性地識別和結(jié)合 DN列 5’-GCCARG-3’（Mingot et al. 2001; Tilburn et al. 1995）。

圖 2-1 融合片段 LL1 的電泳檢測Fig.2-1 Amplification of ligation fragments LL1圖 2-2 連接片段 RR1 的電泳檢測
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.611

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本文編號：2707014