【摘要】：NAC轉(zhuǎn)錄因子(NAM、ATAF1/2、CUC2)廣泛存在于植物中,除參與植物生長發(fā)育外,還在抵御生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用,并已用于基因工程來改善植物的脅迫耐受性。中國水仙為冬季主要觀賞花卉之一,其產(chǎn)量和品質(zhì)在程度一定上受外界環(huán)境因子影響。目前對中國水仙NAC轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下的調(diào)節(jié)作用知之甚少,因此克隆和鑒定優(yōu)良非生物脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義。本研究選用多花水仙新品種‘云香’為材料,基于其花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,以RT-PCR技術(shù)克隆得到2個NtNAC(NtNAC1和NtNAC2)基因,并通過qRT-PCR技術(shù)分析了兩個基因的時空表達模式以及在逆境和逆境相關(guān)激素處理下的表達變化,結(jié)合分析過表達轉(zhuǎn)基因煙草植株在干旱和高鹽脅迫下的表現(xiàn)等解析了兩個基因的功能。主要的研究結(jié)果如下:NtNAC1基因全長1 083 bp,其ORF為918 bp,編碼306個氨基酸,N端含有NAM保守結(jié)構(gòu)域,聚分在SNAC1亞組,與香蕉MusaSNAC1、小麥TaNAC47親緣關(guān)系較近。實時熒光定量分析顯示,NtNAC1表達水平隨花器官花瓣和副冠的發(fā)育呈先上升后下降趨勢,始花期達到峰值;NtNAC1在根和葉中高表達,受ABA、MeJA、SA、H_2O_2、NaCl、PEG誘導上調(diào),推測該基因可能參與‘云香’水仙花器官的形態(tài)建成及響應非生物脅迫。進一步構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)化煙草,獲得9株轉(zhuǎn)基因植株。在高鹽和干旱脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)達、長勢更好、存活率高。此外,過表達轉(zhuǎn)基因株系中抗逆相關(guān)基因P5CS、APX上調(diào)表達、SOD、POD酶活性提高及MDA的含量下降,減輕了脅迫造成的細胞膜損傷。NtNAC2基因的開放閱讀框為936 bp,編碼312個氨基酸。生物信息學分析顯示,NtNAC2基因在N端含有NAM保守結(jié)構(gòu)域,與單子葉植物蘆筍、番紅花和石斛等具有較近的進化關(guān)系。實時熒光定量檢測顯示,花瓣和副冠中NtNAC2基因的表達量隨花器官發(fā)育逐漸上升,衰敗期達到峰值;在ABA、MeJA、SA、H_2O_2、50℃、NaCl和PEG脅迫處理下,水仙根和葉中NtNAC2基因的表達量上調(diào),且表現(xiàn)出時空表達特異性。為進一步鑒定其功能,構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草,獲得10株轉(zhuǎn)基因煙草,經(jīng)半定量RT-PCR檢測NtNAC2基因在轉(zhuǎn)基因植株中過表達。高鹽和干旱脅迫處理后,過表達轉(zhuǎn)基因植株根長為野生型的2~3倍,葉片失水率低于30%,存活率高于60%,抗逆相關(guān)基因P5CS、APX的轉(zhuǎn)錄水平上升,MDA的積累更少,SOD和POD酶活性更高。綜上所述,‘云香’水仙NtNAC1和NtNAC2過表達能提高煙草對高鹽、干旱的耐受性,在抗逆中起正向調(diào)控作用,可作為提高水仙抗性的優(yōu)良遺傳基因資源,用于培育水仙抗性新品種。
【圖文】：

N 端有約 40 個氨基酸組成的延伸區(qū)域（NTE），電離輻射處理調(diào)控輻射損傷響應蛋白激酶 ATM、ATR 通路[24]。此外，還有部典型結(jié)構(gòu)相反，保守結(jié)構(gòu)域位于 C 端，TRR 位于 N 端，兩者之鋅指結(jié)構(gòu)（ZF），類似于維管植物擬南芥 AtVOZ1 和 AtVOZ2[24著生物信息學技術(shù)的發(fā)展，NAC 轉(zhuǎn)錄因子 N 端結(jié)構(gòu)域的二、三Ernst 等[26]采用 X 射線結(jié)晶學方法研究雙子葉植物擬南芥 ANAC構(gòu)，這是 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族第一個確定蛋白結(jié)構(gòu)的成員，該蛋含傳統(tǒng)的α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋結(jié)構(gòu)，而以 3 個α-螺旋環(huán)繞 6 個反向成，通過鹽橋等形成功能性二聚體結(jié)構(gòu)，，其表面富含正電荷，參后對單子葉植物水稻 SNAC1 保守結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)進行研究，CAC1 與 ANAC019 結(jié)構(gòu)域折疊方式相似，該蛋白結(jié)構(gòu)域一側(cè)由β-折疊及 3 個α-螺旋纏繞組成中心半β-桶狀蛋白，而另一側(cè)處于開見，NAC 轉(zhuǎn)錄因子二聚體結(jié)構(gòu)在進化過程中相對保守，多數(shù) NA形式發(fā)揮調(diào)控作用[27]。

2.3.1 NAC 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的作用植物經(jīng)常遭受干旱、高鹽等非生物脅迫，對其生長發(fā)育造成負面影響，這促使植物進化出一系列生理和分子機制以適應非生物脅迫。為更好地應對逆境脅迫，以 NAC 轉(zhuǎn)錄因子作為研究目標，通過分子育種方法來改善植物的脅迫耐受性很有意義。研究表明，植物在逆境脅迫下，外源激素 ABA、SA、JA、MeJA、ET 等信號分子影響 NAC 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控脅迫誘導基因的表達，響應逆境脅迫（圖 1-2）[45-47]。ABA 信號分子最為常見，由于啟動子元件存在差異，一般受ABA 依賴性和 ABA 非依賴性信號途徑的調(diào)控[48]。Puranik 等[11]提出 NAC 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，啟動子區(qū)域存在多個脅迫響應元件，例如典型的 ABA 依賴性信號轉(zhuǎn)導順式作用元件 ABREs，ABA 非依賴性信號轉(zhuǎn)導的順式作用元件 DREBs（干旱）、LTREs（低溫）等，可結(jié)合相應的脅迫轉(zhuǎn)錄因子，激活或抑制 NAC 基因的轉(zhuǎn)錄水平。
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S682.21

【參考文獻】

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本文編號：2704800