【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum)是園藝學(xué)研究中重要的模式植物,含有豐富的抗壞血酸(AsA)等營養(yǎng)成分。DNA甲基化是動(dòng)物和植物中都存在的一種表觀修飾,在植物生長發(fā)育中行使重要功能。DNA甲基化對(duì)番茄果實(shí)AsA等營養(yǎng)品質(zhì)形成調(diào)控有待探索。本課題是從實(shí)驗(yàn)室已鑒定的AsA途徑中的關(guān)鍵基因入手,通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法來研究甲基化調(diào)控對(duì)番茄中AsA含量的影響。本課題的主要結(jié)果如下:1、將實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)鑒定的GMP、GME等基因通過生物信息學(xué)的方法進(jìn)行比對(duì),尋找同源基因,并通過查閱文獻(xiàn)尋找其他AsA途徑相關(guān)基因,共得到61個(gè)AsA合成代謝相關(guān)基因�；诜巡煌l(fā)育成熟階段RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)AsA相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明,AC在花后17 d有超過18個(gè)基因顯著表達(dá),AC在花后42 d有超過14個(gè)基因顯著表達(dá)。分析AsA相關(guān)基因在成熟過程中甲基化水平,結(jié)果表明,大部分是CG類型的DNA甲基化,在果實(shí)發(fā)育成熟過程中,基因編碼區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)域相對(duì)于基因下游更易受到甲基化調(diào)控。2、基于轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析了番茄基因SlDML2和SlMET1的CRISPR材料中AsA相關(guān)基因的變化規(guī)律。結(jié)果表明,在SlDML2和SlMET1的番茄CRISPR材料中共同受甲基化調(diào)控的基因有5個(gè),分別是GR-1、GalUR-5、GME-1、AO-1和APX-7。進(jìn)一步分析上述材料中AsA相關(guān)基因的甲基化水平,鑒定了AsA合成相關(guān)基因中GalUR-5基因顯著受表觀遺傳調(diào)控。3、分別用水和甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-azaC)處理番茄AC種子和果實(shí)開花時(shí)期的花梗,觀察處理后種子的萌發(fā)和果實(shí)的發(fā)育成熟。結(jié)果表明,5-azaC處理的種子發(fā)芽率達(dá)到了95%,而對(duì)照只有72%的發(fā)芽率;果實(shí)處理后大約提早5 d成熟。測(cè)定抗壞血酸含量,結(jié)果表明,5-azaC處理后葉片AsA含量相比對(duì)照顯增加了37%;5-azaC處理后果實(shí)中AsA含量相比對(duì)照在破色時(shí)期增加了44%。4、對(duì)5-azaC處理后的植株葉片和果實(shí)進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)葉片和果實(shí)中的GalUR-5基因均上調(diào)表達(dá),利用酶切PCR方法進(jìn)行GalUR-5的甲基化水平測(cè)定,結(jié)果表明,5-azaC處理的果實(shí)在花后25 d和花后38 d的甲基化水平低于對(duì)照。5、對(duì)GalUR酶的活性進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn),5-azaC處理的果實(shí)和葉片中酶活均有增加,并在果實(shí)成熟階段更加顯著,說明DNA甲基化水平下降促進(jìn)了GalUR酶的酶活力,從而促進(jìn)了AsA的積累。通過生物信息學(xué)分析GalUR-5的保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)和組織表達(dá)譜,結(jié)果表明,GalUR-5保守結(jié)構(gòu)域?yàn)锳ldo_ket_red,與草莓中GalUR保守結(jié)構(gòu)域相同,與草莓GalUR氨基酸同源性為25%。
【圖文】：

物抗壞血酸生物合成主要途徑（Mellidou and K影響 AsA 生物合成的方式（*調(diào)節(jié)酶活性，**調(diào)控or AsA biosynthetic pathway in plant (Mellidou a indicate how transcription factors influence AsA bi(*enzyme activity, ** regulates protein translation)（GalDH）催化 L-半乳糖生成 L-半乳糖-1,成中的轉(zhuǎn)化效率高，所以在植物中含量很少sA 產(chǎn)生顯著的影響（Alhagdow et al 2007）不在此（Smirnoff et al 2000）。最早在豌豆中被克隆。擬南芥中超量表達(dá) GalDH 基因發(fā)化不顯著，從側(cè)面驗(yàn)證了合成途徑中的限速則降低了酶活性，此后在菠菜（Mieda et（鄒禮平 2009）中都有克隆到 GalDH。

DNA 甲基化對(duì)番茄果實(shí)抗壞血酸合成積累的調(diào)控研究根據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶依據(jù)甲基轉(zhuǎn)移酶的 C 末端催化結(jié)構(gòu)分為四個(gè)不同的家族：DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNMT1）家族，DNMT3 家族，DNMT2家族和 CMT 家族（鄭小梅和吳寧峰 2009）。甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1 是真核生物研究中發(fā)現(xiàn)的基因（Du et al 2015）。甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1 與 DNA 復(fù)制直接相關(guān)（施金龍 2010）。DNMT1 有從頭甲基化的能力和 DNA 復(fù)制去甲基化的功能，突變后的 DNMT1 可以啟動(dòng)甲基化過程，，植物中 DNMT1 家族又稱為 MET 家族（Du et al 2015）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S641.2

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本文編號(hào)：2690096