【摘要】：文心蘭(Oncidium hybridum)為蘭科(Orchidaceae)樹(shù)蘭亞科(Epidendroideae)文心蘭屬的植物,其花序分支性良好,花形優(yōu)美,盛開(kāi)時(shí)宛若飛舞的女郎,因此又有跳舞蘭之稱(chēng)。文心蘭作為我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)第一大外銷(xiāo)切花花卉,主要以文心蘭'南茜'(nc.Gower Ramsey)和'檸檬綠'(Onc.Honey Angel)為主,顏色均為單一黃色。然而歐洲國(guó)家對(duì)黃色系花卉的接受程度不高,在這些國(guó)家黃色系花卉代表分離和哀傷,因此若要拓展文心蘭的外銷(xiāo)市場(chǎng),需有不同花色品種的育成,來(lái)提高市場(chǎng)對(duì)文心蘭切花的接受程度。但'南茜'和'檸檬綠'具有自交和雜交不親和性,在自然條件下無(wú)法進(jìn)行天然授粉而獲得果莢,并且經(jīng)多方努力進(jìn)行雜交試驗(yàn),仍無(wú)法育出新品種。目前,相關(guān)研究人員已對(duì)'南茜'雜交不親和性問(wèn)題進(jìn)行了初步探討,發(fā)現(xiàn)其花粉敗育是導(dǎo)致雜交授粉困難的主要原因。因此,本研究打算從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩個(gè)方面對(duì)'檸檬綠'花粉敗育問(wèn)題進(jìn)行初步探討,藉此找出其花粉敗育的原因,為文心蘭雜交育種的研究提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1文心蘭花粉的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察通過(guò)對(duì)文心蘭不育品種'檸檬綠'、'南茜'和可育品種'巧克力'的花粉團(tuán)形態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)'檸檬綠'和'南茜'的花粉團(tuán)藥室明顯變扁,外壁凹陷、皺縮,組成花粉團(tuán)的花粉粒排列非常緊密,形狀不規(guī)則,并且'檸檬綠'成熟的花粉團(tuán)中無(wú)明顯的花粉粒附著現(xiàn)象�；ǚ哿５膾呙桦婄R觀察結(jié)果顯示:與可育品種'巧克力'相比,不育品種'檸檬綠'的花粉粒大小和形狀不規(guī)則,花粉壁發(fā)育不連續(xù),有很多孔洞(并非萌發(fā)孔)。顯微觀察發(fā)現(xiàn),'檸檬綠'花粉細(xì)胞大小和形狀不規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)高度液泡化�；ǚ勰讣�(xì)胞的DAPI染色結(jié)果顯示,'檸檬綠'花粉母細(xì)胞在減Ⅰ末期及減Ⅱ末期形成的子細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)未實(shí)現(xiàn)均等分配,從而產(chǎn)生的四分體小孢子中含有數(shù)目不等的染色體。在減Ⅱ末期,甚至?xí)纬扇煮w小孢子或多分體小孢子。綜上所述,'檸檬綠'花粉敗育可能與以下問(wèn)題有關(guān):1.花粉壁發(fā)育異常。此問(wèn)題會(huì)造成花粉細(xì)胞內(nèi)含物外流,而內(nèi)含物的外流將無(wú)法為小孢子的正常發(fā)育提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而影響小孢子的正常發(fā)育。2.花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程異常。'檸檬綠'花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中可能出現(xiàn)同源染色體的配對(duì)、聯(lián)會(huì)和重組等環(huán)節(jié)異常,從而導(dǎo)致小孢子中含有數(shù)量不等的染色體,影響其正常發(fā)育。2文心蘭與堇花蘭花粉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析以文心蘭和堇花蘭花粉為材料,采用第二代高通量Illumia HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,利用生物信息學(xué)分析二者之間的差異表達(dá)基因,并利用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。本研究共獲得132,789條Unigenes,按照差異倍數(shù)不低于4(|log2Ratio|≥4)且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率不高于0.001(FDR≤0.001)為條件篩選出48,066條DEGs,其中上調(diào)表達(dá)的基因16,527條,下調(diào)表達(dá)的基因31,539條。與花粉發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因的數(shù)目是1200個(gè),其中上調(diào)基因數(shù)量475個(gè),下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量725個(gè),涉及花粉發(fā)育、花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)、花粉壁形成、減數(shù)分裂等相關(guān)基因。從上述1200個(gè)差異基因中挑選了 145個(gè)進(jìn)行層次聚類(lèi)分析,篩選出31條具有顯著性差異表達(dá)的基因,上調(diào)表達(dá)的基因7條,下調(diào)表達(dá)的基因24條。為了驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性,本研究從31條顯著差異表達(dá)基因中選取了 9條基因進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明這9個(gè)差異表達(dá)基因qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致性很好,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可信度高。結(jié)合上述分析結(jié)果,以差異表達(dá)基因的功能注釋為依據(jù),從上述9條差異表達(dá)基因中選取了 5條基因進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析,結(jié)果表明這5條差異基因在可育植株堇花蘭和'巧克力'中的表達(dá)量均顯著高于'檸檬綠',差異倍數(shù)均大于3,證明篩選出的基因確實(shí)為'檸檬綠'和堇花蘭花粉發(fā)育過(guò)程中顯著差異表達(dá)的基因。3文心蘭OnMAD2基因的克隆、生物信息學(xué)及定量表達(dá)分析參考文心蘭'檸檬綠'花粉團(tuán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中OnMAD2基因的已知序列,本試驗(yàn)對(duì)文心蘭OnMAD2的CDS區(qū)進(jìn)行了驗(yàn)證和一系列分析。RT-PCR結(jié)果顯示:OnMAD2的基因編碼區(qū)624bp,編碼207個(gè)氨基酸;gDNA長(zhǎng)度為961bp,含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):文心蘭OnMAD2屬于HORMA超家族,具有HORMA結(jié)構(gòu)域,文心蘭OnMAD2與石斛蘭MAD2(PKU87023.1)的親緣關(guān)系最近,其次是深圳擬蘭(PKA55503.1)。OnMAD2的蛋白序列與其他物種的MAD2蛋白序列具有較高的相似性,均在70%以上,說(shuō)明MAD2蛋白在植物中具有很強(qiáng)的保守性。不同組織器官的qRT-PCR結(jié)果顯示:文心蘭OnMAD2在根中具有極高的表達(dá)水平,在假鱗莖中的相對(duì)表達(dá)量最低,具有明顯的組織特異性,推測(cè)該基因可能在根中能夠正常表達(dá)。不同花期的qRT-PCR結(jié)果顯示:文心蘭OnMAD2在半開(kāi)放期的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是盛開(kāi)前期,在盛開(kāi)期的相對(duì)表達(dá)量最低。推測(cè)該基因可能在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中起控制染色體分離的作用。4文心蘭OnMYB106基因的克隆、生物信息學(xué)及定量表達(dá)分析參考文心蘭'檸檬綠'轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中OnMYB106基因的已知序列,本試驗(yàn)對(duì)文心蘭OnMYB106的CDS區(qū)進(jìn)行了驗(yàn)證。RT-PCR結(jié)果顯示:OnMYB106的基因編碼區(qū)819bp,編碼272個(gè)氨基酸;gDNA長(zhǎng)度為1005bp,含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):OnMYB106屬于SANT超家族,具有2個(gè)連續(xù)的MYB結(jié)構(gòu)域,是一個(gè)典型的R2R3-MYB。OnMYB106與水稻的OsMYB106(OC_Os08g33660.1)的進(jìn)化距離最近,推測(cè)這兩個(gè)基因可能具有相似的功能,都屬于調(diào)控花粉發(fā)育的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。不同組織器官的qRT-PCR結(jié)果顯示:文心蘭OnMYB106在花器官中具有較高的表達(dá)水平,在其它組織部位雖有表達(dá),但表達(dá)量都很低,推測(cè)該基因可能在花器官的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。不同花期的qRT-PCR結(jié)果顯示:文心蘭OnMYB106在花苞期的表達(dá)量最高,盛開(kāi)期時(shí)只有微量表達(dá),推測(cè)該基因?qū)儆诨ǚ郯l(fā)育“早期”表達(dá)的基因,主要調(diào)控花粉壁的合成。5文心蘭OnMAD2和OnMYB106基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本試驗(yàn)利用傳統(tǒng)的酶切連接法將OnMAD2和OnMYB106目的基因與植物表達(dá)載體pCAM-BIA1301相連接,成功構(gòu)建了兩個(gè)過(guò)表達(dá)載體p1301-MAD2-GUS和p1301-MYB106-GUS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入文心蘭PLBs中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因PLBs中均有GUS和潮霉素基因。qRT-PCR與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相一致,GUS基因僅在陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因PLBs中有表達(dá)。目的基因的qRT-PCR結(jié)果顯示:相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,文心蘭OnMAD2與OnMYB106在轉(zhuǎn)基因PLBs中均呈現(xiàn)極顯著升高,綜合上述結(jié)果說(shuō)明p1301-MAD2-GUS和p1301-MYB106-GUS兩個(gè)過(guò)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化成功。
【圖文】：

鏈邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｓｔｒａｎｄｅｄ邋ｃＤＮＡ，用邋Ｃｏｖａｒｉｓ邋Ｓ２２０邋先將第一鏈邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｓｔｒａｎｄｅｄ邋ｃＤＮＡ邋打斷，逡逑其后接上邋ａｄａｐｔｏｒ，再使用邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋ＩｎＤＡ－Ｃ邋ｐｒｉｍｅｒ邋去除邋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ａｎｄ逡逑ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｒＲＮＡ后，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增ｃＤＮＡ，完成測(cè)序文庫(kù)構(gòu)筑（圖３－２）。逡逑其后使用兩套系統(tǒng)對(duì)測(cè)序文庫(kù)濃度與品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。一套為Ｑｕｂｉｔ？邋２．０逡逑Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ邋，搭配其邋ｄｓＤＮＡ邋Ｈｉｇｈ邋Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋Ｋｉｔ。另一套為邋Ａｇｉｌｅｎｔ邋２１００逡逑Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，使用其ＤＮＡ邋１０００邋Ａｓｓａｙ進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)測(cè)序文庫(kù)品質(zhì)良好后即可逡逑進(jìn)行定序。逡逑２２逡逑

邋Ｉ丨丨ｍｕｎｉｎａ測(cè)序及測(cè)序質(zhì)量評(píng)估逡逑使用ｎｉｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ？４０００測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的定序，測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)堿基讀出系統(tǒng)（ｂａｓｅ邋ｃａ丨ｌｉｎｇ）轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，序列數(shù)據(jù)即原始邋ｄａｔａ或ｒａｗ邋ｒｅａｄｓ邋），結(jié)果以ｆａｓｔｑ文件格式記錄，其中包括序列信息序列的質(zhì)量信息。每個(gè)堿基的錯(cuò)誤率利用測(cè)序質(zhì)量值ＱＶ邋（Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｖａｌｕ邋－１０１ｏｇｌ０（Ｐｅ），邋Ｐｅ為定序可能的錯(cuò)誤率）進(jìn)行評(píng)估，，ＱＶ值是指測(cè)序過(guò)別過(guò)程中，對(duì)所識(shí)別的堿基給出的錯(cuò)誤概率。表３－１為測(cè)序質(zhì)量值ＱＶ誤率Ｐｅ的對(duì)應(yīng)關(guān)系。ＱＶ值越大測(cè)序錯(cuò)誤率越低，序列準(zhǔn)確度越高。ＱＶ該位點(diǎn)堿基的正確判別率２９９％，錯(cuò)誤率￡丨％。一般情況下，為了確定中堿基的正確識(shí)別率，以Ｑ２０（ＱＶ＝２０）表示堿基的測(cè)序質(zhì)量，只要堿２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S682.31

【參考文獻(xiàn)】

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