【摘要】：魔芋系天南星科(Araceae),魔芋屬(Amorphophallus)植物的總稱,它是一種多年生草本植物。在中國,魔芋資源豐富,具有悠久的栽培歷史,在21個魔芋種中有11個種可以食用,其中6個種已有栽培。因其塊莖中含有大量的葡苷聚糖(glucomanna)和生物堿等物質(zhì)而在食品、醫(yī)藥、化工中具有廣泛應(yīng)用,具有較高開發(fā)利用價值。有關(guān)魔芋組織培養(yǎng)的研究在上個世紀(jì)80年代就早有報道,但因魔芋為單葉柄支撐的單復(fù)葉植物通常用地下根狀莖無性繁殖,其繁殖系數(shù)非常低再加上種芋根莖細(xì)嫩不能長距離運(yùn)輸,使得魔芋繁殖一直阻礙著其的大面積發(fā)展,優(yōu)良品種推廣速度慢。目前,關(guān)于魔芋的生物學(xué)特性研究以及其塊莖中富含的葡甘聚糖的提取加工研究較多,但對魔芋塊莖中他有效成分(如神經(jīng)酰胺)及其代謝途徑研究甚少。本研究不僅對魔芋組織培養(yǎng)中不同類型的愈傷組織進(jìn)行了研究,還利用高通量測序(RNA-seq)技術(shù)對魔芋進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并將其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得蛋白質(zhì)功能注釋、GO功能分析、KEGG代謝途徑等數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上篩選到了神經(jīng)酰胺代謝途徑上的關(guān)鍵基因-中性神經(jīng)酰胺酶基因(NCase),對其進(jìn)行了克隆以及初步功能驗(yàn)證。研究結(jié)果如下:利用白魔芋(A.albus)的雌蕊花序以及雄蕊為外植體,得到了5種不同類型的愈傷組織,對比了胚性愈傷非胚性愈傷組織之間的差別,并對魔芋胚性愈傷組織的發(fā)育過程進(jìn)行了組織切片觀察,從中找到了胚性愈傷組織具有發(fā)育各個時期典型特點(diǎn)的組織結(jié)構(gòu)。此外本研究還探討了最佳的外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分化培養(yǎng)基的激素種類及配比以及其pH值;培養(yǎng)的光照、溫度等。優(yōu)化組合得到白魔芋愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 2,4-D+3 mg/L 6-BA,30g/L蔗糖,2g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP),白愈傷組織最適合的分化培養(yǎng)基為:MS+1 mg/L NAA+1 mg/L GA3+2 mg/L 6-BA,30g/L 蔗糖,2g/L PVP。白魔芋愈傷組織的誘導(dǎo)率最高可達(dá)到98.9%,分化率達(dá)到83.7%。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白魔芋轉(zhuǎn)基因。在前面建立的胚性愈傷組織的快繁體系的基礎(chǔ)上,通過預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)篩選得到陽性愈傷組織,以Plasmid pCAMBIA1300為表達(dá)載體,將抗蟲基因Cry2A基因轉(zhuǎn)入到魔芋胚性愈傷組織中。提取再生植株葉片基因組并對其進(jìn)行PCR檢測,初步證明外源基因已轉(zhuǎn)入到再生植株中,在實(shí)驗(yàn)得到的6株再生植株中有兩株再生植株基因組中能檢測到Cry2A外源基因的成功轉(zhuǎn)入。利用Illumina HiSeq 2500高通量測序?qū)浝漳в?Amorphophallus muelleri)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,獲得彌勒魔芋15,867,314原始讀序,數(shù)據(jù)量4.76G。除去含有帶接頭的、低質(zhì)量的原始讀序,對原始數(shù)據(jù)過濾,得到15132167個讀序,數(shù)據(jù)量為4.54G。通過高級分析,給出所有all-unigene在樣品中的表達(dá)量信息和功能注釋信息,功能注釋信息包括KOG功能注釋和GO功能注釋、Pathway注釋,揭示了彌勒魔芋葉片中基因的表達(dá)狀況。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中我們分析得到彌勒魔芋經(jīng)酰胺的代謝途徑及代謝途徑中相關(guān)的13個酶。我們選擇了起到中樞調(diào)節(jié)作用的中性神經(jīng)酰胺酶(neutral ceramidase)作為研究對象。首先我們通過RACE的方法,克隆得到了彌勒魔芋中性神經(jīng)酰胺酶(NCase)的基因序列,為了進(jìn)一步驗(yàn)證NCase的功能,我們將其轉(zhuǎn)入到人工進(jìn)行基因敲除的酵母,人工敲除釀酒酵母中神經(jīng)酰胺酶基因YPC1p和YDC1p,排除酵母本身的干擾后,將得到的魔芋中性神經(jīng)酰胺酶基因轉(zhuǎn)入雙缺型酵母中,通過Western blot檢測到不同時期神經(jīng)酰胺酶表達(dá)量的不同。以C12-NBD神經(jīng)酰胺將作為底物,在體外一定條件下反應(yīng),通過高效液相色譜儀(HPLC)的檢測,我們發(fā)現(xiàn)魔芋NCase能夠分解Cl 2-NBD神經(jīng)酰胺。本研究首次探索了彌勒魔芋神經(jīng)酰胺酶與各種干擾素通路中相關(guān)基因的相互作用,發(fā)現(xiàn)魔芋中性神經(jīng)酰胺酶能促進(jìn)IFNα IFNβ,ISRE以及IL29的表達(dá),NCase能夠直接引起相關(guān)干擾素的基因的上調(diào),而干擾素刺激會引起下游干擾素誘導(dǎo)基因(IFN stimulated genes,ISGs)表達(dá)變化,從而起到抗病毒的作用,研究還發(fā)現(xiàn)魔芋中性神經(jīng)酰胺酶能對EV71病毒產(chǎn)生抑制作用,揭示了彌勒魔芋其在抗病毒方面的巨大潛力。
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組織的再生體系研究還很少，而且誘導(dǎo)以及分化效率不高。本研究用白魔兩種外植體為材料成功高效的誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并在此基礎(chǔ)之上建立于白魔芋胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)基因再生體系，成功將基因轉(zhuǎn)入到了白中。逡逑２．１材料與方法逡逑２．１．１實(shí)驗(yàn)材料逡逑材料來自于湖北恩施的白魔宇，，魔芋球蓮頂有花芽。保存于溫度在２８－３２度室內(nèi)備用。逡逑大腸桿

本文編號：2685904