【摘要】：柑橘作為世界上最重要的果樹之一,許多種類的柑橘都能積累花青苷。花青苷屬于黃酮類化合物家族,是植物的次生代謝物質(zhì),對柑橘果實(shí)品質(zhì)的形成、逆境的抵抗及人類健康等方面都有非常重要的作用。目前柑橘中花青苷的調(diào)控研究,在血橙(Citrus sinensis)中有深入的研究,對于其他積累花青苷的柑橘品種的花青苷調(diào)控研究較少。柚子是柑橘的三大基本種之一,目前所有的栽培柚子果實(shí)不積累花青苷,果皮主要呈現(xiàn)黃色或是橙黃色。本課題組在湖北恩施找到了一份野生的柚子資源“紫皮柚”(Citrus maxima),可以在果皮中積累花青苷而呈現(xiàn)不同于普通栽培柚子的紫紅色。關(guān)于紫皮柚花青苷積累的機(jī)制還不清楚。蠔殼刺作為柑橘的一個(gè)原始種(Atalantia buxifolia),果皮和嫩葉中都可以積累花青苷,且果皮和嫩葉中積累的花青苷成分差別很大,這暗示著蠔殼刺果實(shí)和嫩葉中花青苷的調(diào)控機(jī)制是不一樣的。因此,本研究以紫皮柚和普通柚子作為研究材料,系統(tǒng)的研究紫皮柚中花青苷的調(diào)控機(jī)制。此外,本論文在紫皮柚的研究基礎(chǔ)上,以原始的柑橘品種蠔殼刺作為研究材料,更進(jìn)一步的探索了柑橘中的花青苷調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1、紫皮柚花青苷成分鑒定及調(diào)控基因挖掘。首先利用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)鑒定了紫皮柚果皮花青苷的主要成分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-O-(丙二酰葡萄糖苷)。通過分析紫皮柚和普通柚子成熟時(shí)期果皮基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),本研究鑒定到了1667個(gè)差異表達(dá)基因,其中包括915個(gè)上調(diào)的基因,712個(gè)下調(diào)的基因,并且花青苷生物合成途徑相關(guān)的基因均有明顯的上調(diào)。通過qRT-PCR技術(shù),鑒定到CgCHS1,CgF3H,CgF3’H,CgDFR,CgANS,CgUFGT1和CgUFGT2以及負(fù)責(zé)花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)的CgGST基因的表達(dá)情況與紫皮柚果實(shí)發(fā)育時(shí)期花青苷合成呈明顯的正相關(guān),調(diào)控基因CgRuby1和CgbHLH1也具有類似的表達(dá)模式,因此被篩選作為候選基因。本研究在CgRuby1基因上游6.7 kb的位置找到了一個(gè)候選的MYB轉(zhuǎn)錄因子,通過qRT-PCR及western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)模式與CgRuby1相反,且該基因蛋白的R2R3結(jié)構(gòu)域均不完整,因此將這個(gè)基因命名為CgRuby2~(Short)作為候選基因進(jìn)行研究。2、提出了紫皮柚花青苷合成調(diào)控模型。首先通過草莓瞬時(shí)表達(dá)和擬南芥穩(wěn)定表達(dá)鑒定了CgRuby1是花青苷合成的激活子,而CgRuby2~(Short)是花青苷合成的抑制子。在雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)中,CgbHLH1的加入,促進(jìn)了CgRuby1對花青苷結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的激活,而CgRuby2~(Short)抑制了CgRuby1-CgbHLH1復(fù)合體的激活能力。通過啟動(dòng)子元件和活性分析發(fā)現(xiàn),紫皮柚果皮CgRuby1的上調(diào)表達(dá),是由于該基因啟動(dòng)子中的CAAT-box和TATA-box元件均是完整的,因此可以使該基因能夠正常表達(dá),而普通柚子中這兩個(gè)元件突變后啟動(dòng)子沒有活性因此CgRuby1不能表達(dá)。通過酵母單雜和凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CgRuby1可以結(jié)合到花青苷結(jié)構(gòu)基因(CgF3'H和CgDFR)的啟動(dòng)子,而CgRuby2~(Short)不能。通過酵母雙雜,雙分子熒光互補(bǔ)及GST pull-down實(shí)驗(yàn),本研究驗(yàn)證了CgRuby1和CgRuby2~(Short)均能分別與CgbHLH1互作,同時(shí)通過競爭性的GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CgRuby2~(Short)能與CgRuby1競爭CgbHLH1。因此推導(dǎo)出CgRuby1是紫皮柚積累花青苷的關(guān)鍵激活子,而CgRuby2~(Short)能與CgRuby1競爭CgbHLH1形成沒有活性的復(fù)合體,作為一個(gè)被動(dòng)的花青苷抑制子起作用的調(diào)控模型。3、紫皮柚花青苷合成受光照誘導(dǎo)。通過套袋實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)紫皮柚花青苷的積累受到光照的影響。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了花青苷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因(CgRuby1)的表達(dá)也受到光照的影響。啟動(dòng)子元件和活性分析表明,CgRuby1啟動(dòng)子是一個(gè)光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,明顯的受到光照影響,而低溫對CgRuby1啟動(dòng)子的活性則沒有任何影響,這表明紫皮柚花青苷的調(diào)控機(jī)制與血橙花青苷受冷誘導(dǎo)的機(jī)制是不一樣的。4、蠔殼刺花青苷調(diào)控基因的挖掘及功能鑒定。通過LC-MS/MS的廣泛靶向代謝組學(xué)方法,鑒定到蠔殼刺成熟果實(shí)中花青苷的主要成分矢車菊色素、飛燕草色素以及這些成分的衍生物。通過qRT-PCR,本研究發(fā)現(xiàn)AbRuby1和AbRuby2基因分別在積累花青苷的果實(shí)和葉片中特異表達(dá)。通過比較AbRuby2和CgRuby2~(Short)的蛋白序列,發(fā)現(xiàn)AbRuby2的R2R3結(jié)構(gòu)域是完整的,因此命名為AbRuby2~(Full)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AbRuby2~(Full)可以促進(jìn)草莓和擬南芥中花青苷的合成,且可以結(jié)合到花青苷結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子上促進(jìn)啟動(dòng)子活性,是一個(gè)柑橘中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控花青苷的激活子。AbRuby2~(Full)的啟動(dòng)子有MITE插入,通過重亞硫酸鹽測序的方法,本研究發(fā)現(xiàn)蠔殼刺積累花青苷的嫩葉AbRuby2~(Full)的啟動(dòng)子甲基程度比不積累花青苷的老葉甲基化程度顯著降低,這影響了AbRuby2~(Full)在嫩葉和老葉的表達(dá),因此造成了花青苷在不同時(shí)期的積累差異。
【圖文】：

野生柑橘花青苷積累的調(diào)控機(jī)理研究花青素穩(wěn)定性不佳，緊接著經(jīng)過 UFGT 的修飾作用，，經(jīng)過糖形成穩(wěn)定的花青苷產(chǎn)物。苷是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中面向細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)合成的，然后被輸送到液道幾種負(fù)責(zé)植物中花青苷轉(zhuǎn)運(yùn)的工作機(jī)制，其中包括谷胱甘肽有毒化合物排出家族（MATE）等。GST 是通過將谷胱甘肽化合物結(jié)合而參與細(xì)胞解毒的二聚體酶(Cheng et al 2015)。+/Na+濃度差產(chǎn)生的電化學(xué)勢能，將花青苷從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸送到液物的組織顯現(xiàn)各種不同顏色(Marinova and Klein 2007)。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文是果皮還是果肉，在整個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期都不積累花青苷（圖 2-1A 和圖 2-1B）。用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)一步分析表明，紫皮柚果皮花青苷主要成分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-O-(丙二酰葡萄糖苷)，且二者的比例約為 1:6（圖 2-1C）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S666

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 徐記迪;柑橘全基因組DNA甲基化分析及調(diào)控作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 余克琴;甜橙果實(shí)發(fā)育與成熟過程中轉(zhuǎn)錄組變化及CsASR基因的功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 曹洪波;轉(zhuǎn)基因調(diào)控柑橘類胡蘿卜素積累的細(xì)胞學(xué)和代謝研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2665540