【摘要】：枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)是重要的柑橘砧木,具有較強(qiáng)的抗寒性,故常作為抗寒研究的重要材料。AP2/ERF是植物系統(tǒng)特有的一類轉(zhuǎn)錄因子大家族,越來(lái)越多的研究表明該家族的一些成員參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育、病菌防御以及非生物脅迫在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程,但大部分成員的功能卻并不清晰。本文以實(shí)驗(yàn)室克隆的PtrERF36基因?yàn)檠芯繉?duì)象,旨在揭示該基因在枳抗寒中的功能和初步抗寒機(jī)制,主要研究結(jié)果如下:1、構(gòu)建PtrERF36-RNAi載體,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化,獲得了202棵枳再生植株,PCR鑒定出29株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為14.36%,對(duì)6個(gè)PtrERF36干涉株系的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)干涉株系的表達(dá)量不同程度地低于野生型,其中#47、#56株系抑制程度最為明顯。2、對(duì)野生型和干涉株系#47、#56進(jìn)行抗寒性分析,結(jié)果表明0℃處理12 h后,干涉系植株受到更為嚴(yán)重的傷害,電導(dǎo)率、MDA及活性氧(H2O2和O2-)含量均高于野生型。POD、SOD酶活性低于野生型。上述結(jié)果表明PtrERF36被抑制后使枳的抗寒性減弱,推測(cè)PtrERF36可能在枳的抗寒性中起著正調(diào)控的作用。3、qRT-PCR分析枳PtrERF36-RNAi系中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)條件下,干涉系中POD、CAT、SOD、COR15以及ICE1等基因的表達(dá)水平均低于野生型。低溫處理后上述基因表達(dá)量有所增加,但干涉系仍低于野生型。其中POD下調(diào)最為明顯,分析POD基因的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)上面含有能與ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的GCC-box,推測(cè)POD可能與PtrERF36有直接的調(diào)控關(guān)系。4、以野生型枳的DNA為模板,PCR克隆獲得PtrERF36的啟動(dòng)子序列,測(cè)序后分析表明,PtrERF36啟動(dòng)子序列含有ABRE、DRE/CRT等與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。
【圖文】：

11圖 2-1 干涉載體 pHELLSGATE8 的示意圖；Fig.2-1 The map of pHELLSGATE8 interference vecto酶

選取已經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株#23、#46、#47、#56、#60、#92 等的葉片適量，按照 2.2.1.1 的方法提取 RNA，然后按照 2.2.4 所述的方法，，用半定量分析和定量分析進(jìn)行干涉抑制效果的分析，結(jié)果如圖3-2所示。從圖3-2A可以看到株系#47、#51、#56 和#60 的抑制效果比較好，而株系#46、#92 的抑制效果不大理想，圖 3-2B進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量分析進(jìn)一步說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題。從圖中可以看到轉(zhuǎn)基因植株的ERF36 基因的表達(dá)量明顯低于野生型，其中株系#47、#51、#56 和#60 下降幅度較株
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S666

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662512