【摘要】：金柑(Fortunella),蕓香科金柑屬植物。金柑作為帶皮鮮食柑橘類水果,果實含有豐富的類黃酮。類黃酮不僅與植物的生長發(fā)育、植物生長素的運輸、植物花色的形成、植物育性以及植物抗性等相關(guān),而且具有抗氧化、消炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、防治心血管疾病、抗腫瘤以及抗癌等功效。植物類黃酮通過苯丙烷途徑進(jìn)行生物合成,是次生代謝研究的熱點,類黃酮生物合成相關(guān)基因已在蘋果、甜橙、草莓以及藤茶等植物中進(jìn)行了研究,但在金柑中還未見報道。MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族、查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因以及查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)基因被大量報道與類黃酮生物合成緊密相關(guān),且具有挖掘潛力。本試驗以金柑果實為試驗材料,探究MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因、查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因在類黃酮生物合成中的作用,以期為闡明金柑類黃酮合成分子機(jī)理提供基礎(chǔ)信息。首先,從金柑果實中克隆7個MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因(FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6、FmMYB7)、3個CHS結(jié)構(gòu)基因(FmCHS1、FmCHS2、FmCHS3)和4個CHI結(jié)構(gòu)基因(FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3、FmCHI4),進(jìn)行生物信息學(xué)分析。然后,以乙醇為溶劑,采用超聲波輔助提取法提取不同發(fā)育階段金柑果實總類黃酮,并用紫外分光光度法進(jìn)行含量檢測。最后通過實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)對不同發(fā)育階段金柑果實中FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6、FmMYB7、FmCHS1、FmCHS2、FmCHS3、FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3以及FmCHI4基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,探討金柑果實發(fā)育過程中基因表達(dá)與類黃酮積累的相關(guān)性,解析基因的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:1、在金柑果實發(fā)育過程中,類黃酮含量隨果實的膨大成熟逐漸降低,在果皮中呈明顯的下降趨勢,在果肉中呈先升后降的變化趨勢。2、FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6與FmMYB7基因全長分別為789、1114、1384、2789、2752、938與2703bp,編碼263、371、461、929、917、312與900個氨基酸,預(yù)測氨基酸編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量與等電點分別為33.95、34.17、37.01、111.37、58.93、32.95、60.22kD與9.20、8.93、5.99、5.29、8.83、8.46、5.10。FmMYB2、FmMYB3與FmMYB6基因緊密聚為一類,FmMYB4與FmMYB7基因聚為一類,FmMYB1基因單獨聚類,均界定為2R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子,在DNA結(jié)合過程中發(fā)揮作用,與類黃酮合成相關(guān);FmMYB5基因單獨聚類,界定為3R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子,對類黃酮積累進(jìn)行多向調(diào)控。實時熒光定量結(jié)果表明,在金柑果實發(fā)育過程中,FmMYB1表達(dá)量呈下降趨勢,在果皮中穩(wěn)定高表達(dá),在果肉中下降;FmMYB2表達(dá)量呈先降后升的變化趨勢,在果皮中先升后降,在果肉中下降;FmMYB3表達(dá)量呈上升趨勢,在果皮中先升后降,在果肉中上升;FmMYB4表達(dá)量呈上升趨勢,在果皮果肉中均先降后升;FmMYB5表達(dá)量呈小幅度上升趨勢,在果皮果肉中均先降后升;FmMYB6表達(dá)量呈上升趨勢,在果皮果肉中均上升;FmMYB7表達(dá)量呈上升趨勢,在果皮果肉中均先降后升。3、FmCHS1、FmCHS2與FmCHS3基因全長分別為821、651與1109bp,編碼273、217與369個氨基酸,預(yù)測氨基酸編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量與等電點分別為42.59、42.80、42.37kD與6.47、5.71、6.05。FmCHS1和FmCHS3與已知功能CHS聚為一類,界定為CHS蛋白;FmCHS2單獨聚類,界定為CHS-like蛋白。實時熒光定量結(jié)果表明,在金柑果實發(fā)育過程中,FmCHS1表達(dá)量呈下降趨勢,在果皮果肉中均下降;FmCHS2表達(dá)量呈先升后降的變化趨勢,在果皮中高表達(dá),在果肉中低表達(dá);FmCHS3呈波動表達(dá),在果皮果肉中均先降后升。4、FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3與FmCHI4基因全長分別為759、1343、2422與898bp,編碼253、447、807與299個氨基酸,預(yù)測氨基酸編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量與等電點分別為23.23、23.98、45.93、31.06kD與5.01、5.04、8.43、8.96。FmCHI2、FmCHI3與FmCHI4界定為TYPE-I CHI蛋白,具有酶催化活性,參與類黃酮合成;FmCHI1界定為TYPE-IV CHI蛋白,與TYPE-I CHI蛋白互作,促進(jìn)類黃酮合成。實時熒光定量結(jié)果表明,在金柑果實發(fā)育過程中,FmCHI1表達(dá)量呈下降趨勢,在果皮中高表達(dá),在果肉中低表達(dá);FmCHI2表達(dá)量呈下降趨勢,在果皮中下降,在果肉中先升后降;FmCHI3表達(dá)量呈先下降后上升再下降的多重變化趨勢,在果皮果肉中均下降;FmCHI4呈波動表達(dá),在果皮果肉中均先降后升。5、FmMYB1、FmMYB2、FmCHS1與FmCHI2在金柑果實發(fā)育過程中呈高表達(dá)模式,與類黃酮積累模式最接近,可能直接參與了類黃酮的生物合成;FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6與FmMYB7對類黃酮合成具有負(fù)向調(diào)控作用,其中FmMYB3與FmMYB6調(diào)控模式相近,FmMYB4、FmMYB5與FmMYB7調(diào)控模式相近;FmCHS2可能與果皮部位類黃酮的合成相關(guān);FmCHS3、FmCHI4對果實膨大期與成熟期類黃酮合成部分路徑進(jìn)行調(diào)控;FmCHI1無催化功能,但與FmCHI2互作促進(jìn)類黃酮合成;FmCHI3在類黃酮形成過程中產(chǎn)生間斷性的影響。
【圖文】：

類黃酮的合成代謝途徑Fig.2Anabolicpathwayofflavonoids

紫外分光法進(jìn)行含量檢測，，分析金柑果實發(fā)育過程中類黃酮含量過實時熒光定量 PCR 技術(shù)，以 Actin 為內(nèi)參基因，對不同發(fā)育 7 個 MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，探討金中基因表達(dá)與類黃酮積累的相關(guān)性，解析 MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基長發(fā)育中的作用以及表達(dá)模式。過實時熒光定量 PCR 技術(shù)，以 Actin 為內(nèi)參基因，對不同發(fā)育 3 個查爾酮合成酶結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，探討金柑基因表達(dá)與類黃酮積累的相關(guān)性，解析查爾酮合成酶結(jié)構(gòu)基因在育中的作用以及表達(dá)模式。過實時熒光定量 PCR 技術(shù)，以 Actin 為內(nèi)參基因，對不同發(fā)育 4 個查爾酮異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，探討金柑基因表達(dá)與類黃酮積累的相關(guān)性，解析查爾酮異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因在育中的作用以及表達(dá)模式。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S666.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2658447