【摘要】：隨著火龍果(Hylocereus undulatus(Haw.)BrittonRose)在我國栽培范圍的不斷擴大,特別易面臨低溫脅迫的影響,在貴州、云南、廣西等南亞熱帶地區(qū)時常會遭遇低溫冷害、倒春寒等極端天氣危害,栽培的火龍果容易發(fā)生冷害和凍害,造成30%左右的減產(chǎn)。近年來,前人在低溫脅迫對火龍果生理影響方面開展了一些研究,為抗寒力評價提供了方法,并開展輻照+低溫和EMS+低溫誘導(dǎo)的研究,初步取得一些抗寒性較好的組培苗�；瘕埞Ｒ�(guī)育種受沒有抗寒力較好資源的限制,也較少開展。前期的研究中發(fā)現(xiàn)通過成年態(tài)火龍果莖段誘導(dǎo)的愈傷組織再分化較困難,進而影響到遺傳轉(zhuǎn)化效率,國內(nèi)外的研究中尚未見火龍果遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)報道。研究者試圖從基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化等方面來尋求突破,為選育抗寒力提升的火龍果品種提供新的途徑和方法。本研究通過開展火龍果花藥培養(yǎng)和莖段培養(yǎng)構(gòu)建再生體系,利用外源LTP基因構(gòu)建載體,以火龍果花藥愈傷組織和莖段為受體分別進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得抗性愈傷組織或抗性芽,開展相關(guān)鑒定,并對再生植株進行形態(tài)觀察和抗寒生理測定,旨在為火龍果遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和抗寒新品種選育提供重要的技術(shù)方案和參考。其主要研究結(jié)果如下:(1)從現(xiàn)蕾起觀測'紫紅龍'火龍果花蕾發(fā)育的動態(tài)變化,采集從現(xiàn)蕾期起1至13天的花蕾,通過電子顯微鏡觀察火龍果小孢子在不同發(fā)育時期的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及細胞學(xué)特征變化,為花藥或小孢子培養(yǎng)提供細胞學(xué)依據(jù)和最佳取材時間,以期建立高效、穩(wěn)定的火龍果花藥或小孢子組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明,火龍果小孢子發(fā)育經(jīng)歷了四分體時期、單核早期、單核靠邊期和雙核期,最后發(fā)育為成熟花粉粒,每個時期具有明顯不同的形態(tài)特征;火龍果小孢子發(fā)育時期與花蕾的大小和花藥的長度緊密相關(guān)�；瘕埞ɡ倏v徑在5.5～6.0 cm,橫徑在2.5～3.2 cm,絕大數(shù)小孢子發(fā)育至四分體時期,此時對應(yīng)的花蕾發(fā)育天數(shù)約為4 d;花蕾縱徑在6.8～7.6 cm,橫徑在3.0～3.4 cm,絕大數(shù)小孢子發(fā)育至單核早期,此時對應(yīng)的花蕾發(fā)育天數(shù)約為5 d;花蕾縱徑在8.1～8.6 cm,橫徑在3.3～3.9 cm,絕大數(shù)小孢子發(fā)育至單核靠邊期,此時對應(yīng)的花蕾發(fā)育天數(shù)約為6 d;雙核期時,花蕾縱徑在8.9～10.5 cm,橫徑在3.8～4.4cm,對應(yīng)的花蕾發(fā)育天數(shù)約7～8d。因此,可以根據(jù)火龍果花蕾的形態(tài)、大小和花藥發(fā)育時期來確定小孢子最佳培養(yǎng)時期對應(yīng)的選蕾標準。(2)以'紫紅龍'火龍果花藥為外植體,研究了小孢子不同發(fā)育時期、低溫預(yù)處理時間、不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度配比對花藥誘導(dǎo)胚性愈傷組織的影響。結(jié)果表明,小孢子發(fā)育處于單核初期至單核靠邊期的花藥,其愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達23.9%,但未能誘導(dǎo)出胚狀體;而4℃低溫預(yù)處理48 h,愈傷組織的誘導(dǎo)率可達32.8%;最適花藥愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為 MS + 2.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D + 60g/L 蔗糖,誘導(dǎo)率為 37.8%,胚性愈傷組織為黃綠色、致密狀,外表有顆粒狀突起。愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+ 0.4 mg/LTDZ+ 0.8 mg/L KT效果較好,增殖系數(shù)達9.1倍以上。愈傷組織再分化培養(yǎng)基為MS + 0.4 mg/L TDZ + 0.5 mg/L 2,4-D + 0.6 mg/L NAA時,愈傷組織再分化率達36.7%。通過火龍果花藥誘導(dǎo)出愈傷組織,增殖獲得大量胚性愈傷組織,再分化形成不定芽,經(jīng)生根和煉苗再生成完整植株,經(jīng)SRAP分子標記檢測遺傳性一致,能為火龍果基因工程育種和種苗快速繁育提供新的途徑。(3)通過HPLC-MS/MS法測定火龍果莖段鮮樣及不同來源愈傷組織的脫落酸(ABA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)四個內(nèi)源激素的含量,以期找到火龍果愈傷組織再分化率低的內(nèi)源激素規(guī)律,為火龍果花藥培養(yǎng)中合理添加外源激素提供一定的理論依據(jù)。結(jié)果表明:火龍果莖段易于誘導(dǎo)愈傷組織與其內(nèi)源IAA和ZT含量較高關(guān)系密切�；瘕埞o段鮮樣中的GA3含量明顯低于莖段或花藥愈傷組織,ABA含量則高于莖段愈傷組織,小于花藥愈傷組織�；ㄋ幷T導(dǎo)的愈傷組織中IAA的含量明顯低于莖段愈傷組織,而ABA的含量卻高于莖段愈傷組織,花藥愈傷組織的ABA/GA3、ABA/IAA的比例都明顯高于莖段愈傷組織,其中未分化花藥愈傷組織的ABA/GA3的比值是莖段愈傷的6.71倍、是可分化花藥愈傷組織的3.82倍,ABA/IAA的比值是莖段愈傷的43.68倍、是可分化花藥愈傷組織的16.02倍,不利于愈傷組織的再分化。由此表明,較高含量的ZT、IAA及較低的GA3/ZT比值有利于火龍果花藥愈傷組織不定芽的分化,而高含量的GA3則會抑制不定芽分化。初步得出提高火龍果花藥愈傷組織分化不定芽的方法,即在培養(yǎng)其中適當增加外源激素ZT和IAA的含量,減少GA3的添加量。(4)以火龍果花藥培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織為受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗寒LTP基因,開展了表達載體構(gòu)建、菌液制備、Kan選擇壓的篩選、農(nóng)桿菌浸染火龍果愈傷組織的方式及時間、共培養(yǎng)時間、選擇培養(yǎng)基、抗性愈傷的PCR檢測、不定芽誘導(dǎo)等研究。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了由CaMV35S啟動子調(diào)控的LTP基因植物表達載體pCAMBIA 3301-LTP,并經(jīng)根癌農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞進入菌體中;75mg/L的Kan濃度為火龍果花藥愈傷組織適宜的選擇壓;花藥愈傷組織的浸染適宜時間為8 min;共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS + TDZ0.4mg/L+2,4-D0.5mg/L + NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L:選擇培養(yǎng)基為:MS + TDZ0.4mg/L + 2,4-D0.5mg/L + NAA0.6mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂7.5 g/L + Kan 75 mg/L + Cef 375 mg/L。采用此轉(zhuǎn)化體系進行遺傳轉(zhuǎn)化,最終得到106個Kan抗性愈傷組織塊,隨機提取5個抗性愈傷組織塊DNA進行LTP基因的特異性擴增檢測,結(jié)果顯示5個抗性愈傷組織塊均擴增出了預(yù)期目的條帶,PCR檢測的陽性率為100%。但后續(xù)抗性愈傷組織未成誘導(dǎo)出不定芽。初步建立了以火龍果愈傷組織為受體農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,可為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。(5)以火龍果無菌組培苗莖段為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗寒LTP基因,開展了 Kan選擇壓的篩選、農(nóng)桿菌侵染方式及時間、共培養(yǎng)時間、選擇培養(yǎng)基、抗性芽PCR和southern雜交檢測研究。結(jié)果表明:50mg/L的Kan濃度為火龍果莖段適宜的選擇壓;莖段的浸染時間為15min;共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:MS + 6-BA2.0mg/L + NAA0.1mg/L +Tryptone 250 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L;選擇培養(yǎng)基為:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L + Tryptone 250 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 瓊脂 7.5 g/L + Kan 50 mg/L + Cef 375 mg/L。采用此轉(zhuǎn)化體系進行遺傳轉(zhuǎn)化,最終得到63個Kan抗性芽,隨機提取8個抗性芽DNA進行Bar基因的特異性擴增檢測,結(jié)果顯示有6個抗性芽擴增出了預(yù)期目的條帶,PCR檢測的陽性率為75.0%,進一步對8個抗性芽進行Southern雜交檢測,結(jié)果有3個材料出現(xiàn)了明顯的雜交信號,表明LTP基因已經(jīng)成功導(dǎo)入火龍果受體中,轉(zhuǎn)化率約為37.5%。后續(xù)對抗性芽進行生根、煉苗,獲得25株再生植株。初步建立了以火龍果莖段為受體農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火龍果遺傳轉(zhuǎn)化體系。(6)對獲得的轉(zhuǎn)LTP基因再生植株進行形態(tài)觀察及抗寒性相關(guān)分析,結(jié)果表明:同等低溫條件下,轉(zhuǎn)LTP基因的火龍果幼苗出現(xiàn)萎蔫及枝條轉(zhuǎn)黃的狀況都較對照明顯減輕:在低溫持續(xù)過程中,轉(zhuǎn)LTP基因植株的REC、MDA含量呈逐漸增加的趨勢,但顯著低于對照;而Pro含量、SOD、POD、CAT酶活性呈先增加后降低的趨勢,且明顯高于對照。綜合表型特征鑒定及抗寒性分析表明,轉(zhuǎn)LTP基因植株較對照對低溫的抵抗力明顯增強,抗寒性顯著提高。
【圖文】：

２．２不同發(fā)育時期火龍果小孢子細胞學(xué)特征變化逡逑跟以往大多數(shù)研究植物小孢子發(fā)育的結(jié)果相似，顯微結(jié)構(gòu)觀察表明火龍果小孢逡逑子發(fā)育同樣經(jīng)歷了四分體時期、單核早期、單核靠邊期、雙核期四個階段（圖２－２）。逡逑在形成四分體時，小孢子外包被著一層透明的肼胝質(zhì)，在卡寶品紅染色下清晰可見逡逑三個細胞，而另一個細胞由于輪廓不明顯在背面不易觀察到。隨后細胞發(fā)育進入單逡逑核早期，此時細胞核位于中央，未觀察到有明顯的液泡。細胞發(fā)育至單核靠邊期時，逡逑較單核早期相比，細胞體積逐漸增大，形成的中央大液泡將細胞核擠壓到細胞的另逡逑一側(cè)，且細胞壁上出現(xiàn)３條明顯的萌發(fā)溝。最后細胞發(fā)育進入雙核期，此時的花粉逡逑己發(fā)育成熟，大部分成熟的花粉粒為近圓形，同時形成了明顯的二核花粉，即具有逡逑１個體積相對較大且靠近大液泡的營養(yǎng)細胞和１個體積相對較小且緊挨花粉壁的生逡逑殖細胞。邐，逡逑■■■■Ｉ邐＾邋ｌ逡逑、？逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ逡逑圖２－２火龍果小孢子各發(fā)育階段的細胞學(xué)特征逡逑注：Ａ

邐Ｄ邋ｒ邋Ｅ逡逑圖２－３不同小孢子發(fā)育時期花蕾和花藥的形態(tài)特征逡逑注：Ａ：四分體時期；Ｂ：單核早期；Ｃ：單核靠邊期；Ｄ，Ｅ：雙核期逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｂｕｄｓ邋ａｎｄ邋ａｎｔｈｅｒ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｓｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ！逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａ：邋ｔｅｔｒａｄ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｂ：邋ｅａｒｌｙ－ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｃ：邋ｌａｔｅ－ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｄ，邋Ｅ：邋ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ逡逑因此，可以根據(jù)火龍果花蕾的形態(tài)、大小和花藥發(fā)育天數(shù)，從而確定小孢子最逡逑佳培養(yǎng)時期對應(yīng)的采樣標準。逡逑２．３小孢子發(fā)育時期對花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響邐．逡逑將‘紫紅龍’火龍果花蕾（圖２－４Ａ）切開，取出花藥（圖２－４Ｂ）接種于預(yù)備培養(yǎng)逡逑基上（圖２－４Ｃ），胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表２－３。小孢子不同發(fā)育時期對愈逡逑傷組織誘導(dǎo)的影響差異較大，雖然各發(fā)育時期的小孢子都能誘導(dǎo)出一定頻率的愈傷逡逑組織，但均未能誘導(dǎo)出胚狀體，以小孢子發(fā)育處于單核靠邊期愈傷組織的誘導(dǎo)率最逡逑高
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S667.9

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本文編號：2649536