【摘要】：‘黃花2號’水仙2012年4月通過福建省農(nóng)作物品種委員會認(rèn)定,是一個花色特異的水仙新品種�！S花2號’水仙正在大面積推廣,急需大量種球。扦插繁殖簡便易行、成本較低、繁殖系數(shù)高,是多花水仙無性繁殖的一項(xiàng)新技術(shù)。本研究以‘黃花2號’水仙扦插繁殖開始(0d)、小鱗莖萌發(fā)(30d)和小鱗莖發(fā)育(50d)三個時期的鱗莖為材料,進(jìn)行不同時期的轉(zhuǎn)錄組比較分析,小鱗莖萌發(fā)和發(fā)育主要與淀粉和蔗糖代謝、細(xì)胞分裂素代謝等主要代謝途徑相關(guān);篩選鑒定出生長素響應(yīng)因子家族(auxin response factor,ARF),并利用了一些生物信息學(xué)的方法對NtARF家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用qRT-PCR主要NtARF基因進(jìn)行了扦插繁殖不同時期的表達(dá)模式分析;在細(xì)胞分裂素途徑中篩選并克隆出關(guān)鍵酶基因5~’-核糖單磷酸水解酶(Lonely Guy,LOG)基因,利用qRT-PCR對扦插繁殖的不同時期和不同組織器官進(jìn)行表達(dá)分析,旨在探索出多花水仙扦插繁殖的分子內(nèi)在機(jī)理,并為進(jìn)一步創(chuàng)新多花水仙的繁殖新技術(shù),提高多花水仙的的繁殖率以及新繁殖技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:1.對‘黃花2號’水仙扦插繁殖0d、30d和50d 3個時期的樣品的測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),分別得到了80281762、77582098和68426350條Clean reads,其中Q20和Q30值均在90%以上,對數(shù)據(jù)組裝共得到167583條Unigene,其中123798條Unigene在Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-prot、KEGG和GO 7個數(shù)據(jù)庫得到注釋。通過扦插繁殖0d和30d兩個比較組分析中,發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因有681個,下調(diào)基因820個、在扦插繁殖0d和50d比較組組中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因1231個,下調(diào)基因1942個、在扦插繁殖30d和50d的比較組中上調(diào)基因有436個,下調(diào)的基因412個。差異表達(dá)基因富集在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號傳導(dǎo)以及玉米素生物合成等主要代謝途徑中。2.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過Nr、Nt、Swiss-Prot和Pfam 4個數(shù)據(jù)庫、NCBI網(wǎng)站和在線軟件SMART的注釋篩選,利用ExPASy-ProtParam tool、SOPMA、Prot Comp、MEME、MAGA和Heml軟件進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)、蛋白二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化樹和小鱗莖萌發(fā)不同時期的表達(dá)模式分析。共篩選得到21個NtARF家族基因,生物信息學(xué)分析12個全長基因蛋白長度在193-1096aa之間,預(yù)測的分子量為20.46-122.2kD,等電點(diǎn)為5.19-7.97,全部為不穩(wěn)定的親水蛋白,亞細(xì)胞定位預(yù)測均位于細(xì)胞核中。通過21個NtARF基因進(jìn)化樹分析表明,NtARF蛋白分為3個大組,GlassⅢ進(jìn)一步被分為3個亞組,基序分支表明相近的ARF轉(zhuǎn)錄因子具有相同或相近的基序。NtARF8、NtARF13、NtARF15、NtARF17和NtARF21都展現(xiàn)較高的表達(dá)模式,可能是通過正向調(diào)節(jié)生長素的含量來促進(jìn)小鱗莖的萌發(fā)。3.從細(xì)胞分裂素途徑中篩選出關(guān)鍵酶基因LOG,并成功克隆出2個LOG基因,分別命名為NtLOG2和NtLOG5,GenBank登錄號為MK170457和MK189487,其中NtLOG2開放閱讀框(ORF)為654bp,編碼217個氨基酸,分子式為C_(1068)H_(1708)N_(300)O_(317)S_9;NtLOG5開放閱讀框(ORF)為648bp,編碼215個氨基酸,分子式為C_(1055)H_(1693)N_(293)O_(314)S_9。NtLOG2和NtLOG5均屬于不穩(wěn)定的親水蛋白�？缒ゎA(yù)測分析表明2個蛋白均不存在跨膜結(jié)構(gòu)。通過qRT-PCR對‘黃花2號’水仙扦插繁殖不同時期和不同組織器官的表達(dá)分析得出,2個NtLOG基因都在0d、30d、50d表現(xiàn)了較高的表達(dá)水平,在水仙不同組織器官的表達(dá)分析中,NtLOG2在花苞期的花瓣里表達(dá)最高,其次在花柄中,而NtLOG5在花柄里表達(dá)最高,其次是根里,然后在花苞期的花瓣中。
【圖文】：

圖 1-1 RNA-Seq 技術(shù)具體步驟Fig.1-1 Specific steps of RNA-Seq Technologyq 技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展等植物研究中，關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用非常多，，主要水果、花卉等園藝作物以及藥用植物等的研究。作物上的應(yīng)用研究：通過轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫對在光合作用、次生代謝的生物合成和苯丙氨酸代謝等方因子家族在水稻低溫脅迫中發(fā)揮重要作用[35]；在玉米兩個在低溫脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的 MYB 基因，并做了芳等在模擬干旱脅迫下野生大豆的轉(zhuǎn)錄組分析共獲得B、WRKY、NAC 等轉(zhuǎn)錄因子在干旱條件下都有明顯的變植物上的應(yīng)用研究：通過西瓜比較轉(zhuǎn)錄組分析，分析維素合成酶（CesA）和多聚半乳糖醛酸酶(PG)等參與

基于‘黃花 2 號’水仙轉(zhuǎn)錄組的小鱗莖萌發(fā)相關(guān)基因研究降低促進(jìn)了光合氣孔關(guān)閉, 可以保留植物體內(nèi)水分，植物進(jìn)而進(jìn)行自我保護(hù)[宓阿娜分別研究了草莓在干旱環(huán)境、高溫環(huán)境和高鹽環(huán)境中 FvLOG 的表達(dá)，現(xiàn) 8 個 FvLOG 基因在干旱環(huán)境中表現(xiàn)為下調(diào)，F(xiàn)vLOG 基因在高溫環(huán)境中表現(xiàn)為下調(diào)，在高鹽脅迫環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)根中和葉中都有不同的 FvLOG 基因上調(diào)和調(diào)。證明了 FvLOG 在植物的逆境中也發(fā)揮重要的作用[81]。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S682.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2642142