【摘要】：茉莉花(Jasminum sambac(L.)Ait)為木犀科素馨屬植物。茉莉花多在夜間開放,是典型的夜花。茉莉花香氣四溢,是著名的花茶原料和香精原料。在茉莉花開放過程中,其香氣的合成、形態(tài)變化及傳粉授粉都需要足夠的能量,因此茉莉花糖含量是決定茉莉花花發(fā)育的重要因素之一。SWEET是最新被發(fā)現(xiàn)的一種參與植物光合作用產(chǎn)物運(yùn)輸和分配的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。此外SWEET蛋白還參與花粉發(fā)育、花蜜分泌、脅迫反應(yīng)等重要生理過程。本課題組前期在茉莉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)找到了7個在花中特異表達(dá)的JsSWEET蛋白家族成員,這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員在茉莉花開花生理中可能發(fā)揮著重要作用。本研究從前期克隆獲得的7個JsSWEET家族基因的cDNA全長的基礎(chǔ)上進(jìn)一步運(yùn)用Gateway融合技術(shù)亞克隆得到它們的植物表達(dá)載體,同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)探究這7個JsSWEET家族基因成員在茉莉花開放前后的表達(dá)水平;對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建,并通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化茉莉花原生質(zhì)體確定蛋白的亞細(xì)胞定位;選取其中JsSWEET9、JsSWEET5、JsSWEET1、JsSWEET17的表達(dá)載體,利用葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛,成功得到轉(zhuǎn)基因植株;構(gòu)建酵母表達(dá)載體,并且在酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能互補(bǔ)試驗(yàn),驗(yàn)證對不同糖類的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.對茉莉花中各SWEET基因之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析,從NCBI搜索得到模式植物雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻的SWEET蛋白序列,利用MUSCLE和MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的分析與繪制。為明確SWEET基因在開花過程的表達(dá)規(guī)律,在14:00 h(花苞前)、17:00 h(花苞期)、23:00 h(半開放)、5:00 h(全開)四個時(shí)間段采集茉莉花花朵樣本,進(jìn)行了定量PCR的實(shí)驗(yàn)分析。提取這四個時(shí)間段茉莉花總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對7個JsSWEET基因進(jìn)行檢測,結(jié)果表明JsSWEET1、JsSWEET2、JsSWEET5、JsSWEET9、JsSWEET10基因在23:00 h時(shí)表達(dá)量最高,JsSWEET16基因在17:00 h時(shí)表達(dá)量最高,JsSWEET17基因在14:00 h時(shí)表達(dá)量最高。2.構(gòu)建了植物表達(dá)雙元載體。從前期已獲得的含有JsSWEET家族基因的T載體中亞克隆JsSWEET1、JsSWEET2、JsSWEET5、JsSWEET9、JsSWEET10、JsSWEET16、JsSWEET17基因的cDNA序列。選擇PK7FWG2載體為骨架載體,運(yùn)用Gateway融合技術(shù)構(gòu)建帶有C-端GFP熒光標(biāo)記的7個茉莉花植物表達(dá)載體,分別命名為PK-JsSWEET1、PK-JsSWEET2、PK-JsSWEET5、PK-JsSWEET9、PK-JsSWEET10、PK-JsSWEET16、PK-JsSWEET17。3.使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,在茉莉花原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)7個JsSWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)JsSWEET5和JsSWEET9轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白明顯定位在原生質(zhì)體的質(zhì)膜上,JsSWEET10及JsSWEET2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也主要分布在質(zhì)膜上,但在胞質(zhì)的某些細(xì)胞器中也有明顯分布。JsSWEET16、JsSWEET1和JsSWEET17轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位情況基本相似,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)分布的熒光較為明顯,但都有別于GFP單獨(dú)表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)熒光。4.選取PK-JsSWEET1、PK-JsSWEET5、PK-JsSWEET9、PK-JsSWEET17載體轉(zhuǎn)化GV3103農(nóng)桿菌感受態(tài),利用葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛。經(jīng)Kan篩選,得到轉(zhuǎn)基因JsSWEET1植株6株,轉(zhuǎn)基因JsSWEET5植株2株,轉(zhuǎn)基因JsSWEET9植株47株,轉(zhuǎn)基因JsSWEET17植株3株。表型初步觀察發(fā)現(xiàn)JsSWEET9農(nóng)桿菌侵染植株表現(xiàn)為植株矮小、葉片變黃、部分植株花冠出現(xiàn)額外的須狀或花瓣?duì)?JsSWEET5農(nóng)桿菌侵染植株表現(xiàn)為植株矮小、部分葉片狹長、花朵變小;JsSWEET1和JsSWEET17農(nóng)桿菌侵染植株待觀察。5.將構(gòu)建好的7個JsSWEET基因酵母表達(dá)載體pRS-JsSWEET1、pRS-JsSWEET2、pRS-JsSWEET5、pRS-JsSWEET9、pRS-JsSWEET10、pRS-JsSWEET16、pRS-JsSWEET17和pRS426對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBYVW4000。通過在麥芽糖為底物的SD(-ura)培養(yǎng)基中選擇后,再將轉(zhuǎn)化不同基因的酵母菌液分別滴在不同糖底物SD(-ura)培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示pRS-JsSWEET5轉(zhuǎn)基因酵母可以在含有麥芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖或半乳糖為底物的SD(-ura)培養(yǎng)基上生長,而在脫氧葡萄糖和麥芽糖為共同底物的SD(-ura)培養(yǎng)基上不能生長。pRS-JsSWEET1分別在麥芽糖、半乳糖為底物的SD(-ura)培養(yǎng)基上生長良好。pRS-JsSWEET1、pRS-JsSWEET2、pRS-JsSWEET9、pRS-JsSWEET10、pRS-JsSWEET16、pRS-JsSWEET17和pRS426轉(zhuǎn)基因酵母只能在麥芽糖底物培養(yǎng)基和麥芽糖加脫氧葡萄糖共同底物培養(yǎng)基上生長。以上研究表明JsSWEET5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、半乳糖和脫氧葡萄糖;JsSWEET1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖;JsSWEET2、JsSWEET9、JsSWEET10、JsSWEET16、JsSWEET17,前面預(yù)測可能分布在細(xì)胞器膜中而不在質(zhì)膜上表達(dá),因而在本實(shí)驗(yàn)中未能確認(rèn)它們的運(yùn)輸?shù)孜铩＿@5個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)有待進(jìn)一步確認(rèn)。
【圖文】：

第一章 前言4 SWEET 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族及研究進(jìn)展4.1 SWEET 蛋白結(jié)構(gòu)SWEET 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以順濃度梯度對糖分進(jìn)行雙向跨膜運(yùn)輸。SWEET 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含 2 個 MtN3/saliva 跨膜結(jié)構(gòu)域，，并且其結(jié)構(gòu)域先后在苜蓿根部結(jié)瘤素和高等真核生物、原生生物、后生動物、真菌、細(xì)菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)[38, 39]。SWEET蛋白在真核生物中具有 7 次跨膜α-螺旋(7 α-helical transmembrane domain,7-TMs)，結(jié)構(gòu)如下圖 1-1。該蛋白是由中心保守性較低的單個跨膜α-螺旋(α-helicaltransmembrane domain, TMs)，連接 2 個重復(fù)的具有 3 次跨膜α-螺旋的 3-TMs(3α-helical transmembrane domain, 3-TMs)構(gòu)成[40]。

圖 2-1 茉莉花定量取材Figure2-1 Quantitative extraction of jasmine和試劑mL 帶蓋熒光定量 PCR 八連管（Axygen，杭州）；LightCycler 9 PCR 儀（瑞士）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TransScript One-Step gDNARemoynthesis SuperMix 、 RNA 提 取 試 劑 盒 、 TransStart Top Green 等均購自全式金生物有限公司，內(nèi)參基因引物為師姐驗(yàn)證過可直驗(yàn)，引物序列及名稱見表 3-1。表 2-1 熒光定量 PCR 引物Table 2-1 Real Time PCR primers引物名稱Primer Name引物序列(5’-3’)Primer Sequence(5’-3’)JsSWEET1-qrt-600f CGTGGAGTTCATGCCCTTCT
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S685.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2637842