【摘要】：MicroRNA(miRNA)是22個(gè)核苷酸(nt)的內(nèi)源性非編碼RNA,能夠響應(yīng)多種非生物脅迫。前人通過高通量測(cè)序挖掘出mi R162是在低夜溫下受脫落酸(Abscisic acid,簡稱ABA)誘導(dǎo)差異表達(dá)的miRNA并推測(cè)miR162調(diào)控DCL1依賴ABA信號(hào)途徑響應(yīng)低夜溫。本試驗(yàn)主要構(gòu)建mi R162超表達(dá)和沉默載體并獲得miR162轉(zhuǎn)基因植株,通過觀察超表達(dá)和沉默植株表型和氣孔超微結(jié)構(gòu),測(cè)定低夜溫下轉(zhuǎn)基因植株Fv/Fm和ABA含量,分析ABA合成、分解以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、冷脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平,并對(duì)miR162靶基因DCL1剪切的三個(gè)miRNAs表達(dá)進(jìn)行分析,明確miR162在低夜溫下調(diào)控氣孔開閉的作用,進(jìn)一步明確miR162在番茄低夜溫脅迫中的具體功能。主要結(jié)果如下:1.mi R162影響了氣孔的開放狀態(tài)。與野生型植株相比,miR162超表達(dá)植株葉片氣孔開放程度降低,而miR162沉默植株氣孔開放程度升高;經(jīng)低夜溫(6℃)處理后野生型植株、miR162超表達(dá)植株和沉默植株氣孔開度降低,但miR162沉默植株氣孔開度在三者中最大,說明miR162的沉默能夠緩解低夜溫下氣孔的關(guān)閉。本研究也發(fā)現(xiàn)低夜溫下miR162沉默植株能夠緩解Fv/Fm的降低抵御低夜溫。2.mi R162影響了番茄葉片ABA含量變化。與野生型植株相比,mi R162超表達(dá)植株ABA含量升高,miR162沉默植株ABA含量降低;經(jīng)低夜溫(6℃)處理后,miR162超表達(dá)植株處理9天時(shí)ABA含量升高,miR162沉默植株處理6天后ABA含量降低,推測(cè)低夜溫下miR162沉默能夠緩解ABA含量升高從而減小氣孔關(guān)閉程度抵御低夜溫。3.mi R162調(diào)控了ABA合成、分解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和冷脅迫重要基因的表達(dá)。相比野生型植株,miR162超表達(dá)植株ABA合成途徑中NCED1、ZEP1、ABA2和AAO,ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ABI3、ABF4、AREB和MYB1上調(diào)表達(dá),ABA分解代謝途徑中CYP707A1和CYP707A2基因下調(diào)表達(dá),在沉默植株中呈現(xiàn)相反趨勢(shì);低夜溫(6℃)處理后,ABA合成、分解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)水平均發(fā)生顯著變化,說明低夜溫下mi R162通過調(diào)控ABA合成、分解及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)影響ABA含量變化。對(duì)冷脅迫基因CBF1、CBF2和CBF3進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)低夜溫誘導(dǎo)了CBF1、CBF2和CBF3的表達(dá),推測(cè)miR162能調(diào)控ABA含量從而調(diào)控冷脅迫重要基因的表達(dá)。4.通過對(duì)受DCL1剪切的mi R160、miR164和miR171a及其相對(duì)應(yīng)靶基因進(jìn)行表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn),miR160、miR164和miR171a在miR162超表達(dá)植株中下調(diào)表達(dá),在miR162沉默植株中上調(diào)表達(dá),其對(duì)應(yīng)的靶基因變化趨勢(shì)與之相反,推測(cè)mi R162可能通過作用DCL1從而調(diào)控miR160、miR164和miR171a的表達(dá)響應(yīng)低夜溫。
【圖文】：

iRNA的合成過程和作用機(jī)制（Noman et al., 2017sis process and mechanism of plant miRNA（Noman研究進(jìn)展iRNAs 中，miR162 能夠被 MIR162a 和 MIR1報(bào)道了擬南芥 miR162a 及其宿主基因中內(nèi)h et al., 2006; Brown et al., 2008），而 MIRN162a 則含有多個(gè)內(nèi)含子并且轉(zhuǎn)錄物需要經(jīng)2002; Hirsch et al., 2006; Brown et al., 2008）a 和 ath-miR162b 具有功能性并能引起 miRNath-miR162b 有相同的核苷酸序列，并且 miIR162b 轉(zhuǎn)錄本至少有兩個(gè)選擇性 3'末端，甚少（Hirsch et al., 2006）。有研究證明了用（20%的含水量的干旱脅迫和鹽脅迫下的剪切和多聚腺苷酸化能夠作用于 miR1。他們證實(shí)了 miR162 在非生物脅迫轉(zhuǎn)錄后

過 C15 途徑和 C40 途徑直接或間接進(jìn)行 ABA 合成，高等接合成（Zeevaart, 1999），主要是通過形成葉黃素以及葉近年來，，已有研究敘述了被子植物中 ABA 合成途徑的詳細(xì)段的環(huán)氧化玉米黃質(zhì)變?yōu)槿词阶宵S質(zhì)，玉米黃素環(huán)氧化的關(guān)鍵酶，同時(shí) ZEP 也是第一個(gè)被鑒定出來參與 ABA 生996）。玉米黃素被 ZEP 催化后轉(zhuǎn)為堇菜黃素，然后 NCED在 ABA2 的影響下黃氧素變?yōu)槊撀渌崛詈竺撀渌崛┩ㄟ^生 ABA，有研究也證明了 ABA 合成途徑中的酶可以被 A進(jìn)一步合成（楊麗霞 等, 2004; 馬延宏, 2009）。2001）研究表明煙草中高含量的 ZEP 催化產(chǎn)物在逆境條件達(dá)的ZEP基因并不能使ABA含量發(fā)生改變。在ABA的合成因只作用 ABA 途徑卻不受 ABA 誘導(dǎo)（Cheng et al., 2002表明 Glc 信號(hào)途徑是由 Glc 與 ABA 的協(xié)同作用結(jié)合 ABA 正信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因被反式激活所介導(dǎo)的，主要原因是由于 ABI5 被 ABA 激活。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S641.2

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