【摘要】：近年來(lái)隨著WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)在一些生物或非生物脅迫下,WRKY的表達(dá)水平受到高度誘導(dǎo)。通過(guò)分析感染和未感染蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)的山楂植株葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)CpWRKY61基因在感染病毒植株中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。本研究從山楂中克隆出CpWRKY61基因編碼區(qū)序列,構(gòu)建CpWRKY61基因過(guò)表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入蘋果中,分析CpWRKY61基因在提高非生物脅迫耐受性的作用,并對(duì)其異位表達(dá)CpWRKY61的蘋果轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。主要研究結(jié)果如下:(1)利用RT-PCR技術(shù)從山楂中克隆出CpWRKY61基因編碼區(qū),編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1842 bp,編碼613個(gè)氨基酸。轉(zhuǎn)錄活性與亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明CpWRKY61是具有轉(zhuǎn)錄激活活性的核定位蛋白。(2)利用qRT-PCR方法檢測(cè)了山楂不同器官中CpWRKY61基因的表達(dá)量,表明CpWRKY61主要在果實(shí)中表達(dá),且隨果實(shí)成熟表達(dá)量顯著升高。紅果期的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高,其表達(dá)水平約為綠果期的2倍,而在幼葉、老葉、莖、花中的表達(dá)量相對(duì)較低。(3)構(gòu)建了CpWRKY61基因的植物過(guò)表達(dá)載體pRI101-CpWRKY61,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化到蘋果‘GL-3’中,得到CpWRKY61基因異位表達(dá)株系3個(gè)。(4)分析非轉(zhuǎn)基因蘋果與CpWRKY61基因異位表達(dá)株系組培苗在100 mM NaCl與300 mM甘露醇脅非生物脅迫下的表型。研究發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因植株葉片受傷害程度明顯高于轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果表明CpWRKY61基因在植物的鹽脅迫和干旱非生物脅迫中起重要調(diào)控作用。(5)對(duì)異位表達(dá)CpWRKY61基因的蘋果轉(zhuǎn)基因株系中OE#2、OE#4及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗O果植株的葉片進(jìn)行高通量測(cè)序分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明CpWRKY61基因可能參與到ABA介導(dǎo)的非生物脅迫相關(guān)基因(MdWRKY7、MdWRKY26、MdWRKY71、MdNCED5、MdLEA14、MdDREB1b)的表達(dá)過(guò)程。利用qRT-PCR檢測(cè)了CpWRKY61基因可能調(diào)控的下游基因,結(jié)果顯示qRT-PCR數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。
【圖文】：

材料與方法高鹽、干旱非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)生長(zhǎng)條件均在光照 14 h、黑暗 10 h 下，，溫度在 長(zhǎng)勢(shì)相同，25 d 左右的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昱c轉(zhuǎn)葉，置于分別用含有 100 mM NaCl、300 mM 甘型。測(cè)序右過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中 2 個(gè)株系的葉片，野生含有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。構(gòu)建 Illumina PE 文量控制，之后利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建流程和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的主要生物信息學(xué)分析流

每個(gè)樣品包含有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。構(gòu)建 Illumina PE 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)所獲的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，之后利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。mRNA-seq文庫(kù)的主要構(gòu)建流程和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的主要生物信息學(xué)分析流程如圖1和圖2中所示。圖 1 mRNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建Fig.1 mRNA-seq library construction圖 2 生物信息學(xué)分析Fig.2 BioinformaticsAnalysis
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S661.5

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本文編號(hào)：2635811