發(fā)布時(shí)間：2020-04-20 12:20

【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum)是一種重要的蔬菜作物,也是研究植物與病蟲互作的經(jīng)典模式植物。番茄在整個(gè)生長(zhǎng)周期中都可能面臨各種病蟲的侵襲,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。茉莉酸(Jasmonicacid,JA)是植物應(yīng)對(duì)機(jī)械傷害、咀嚼式昆蟲和死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌侵害的重要植物激素。一般來說,植物通過核心轉(zhuǎn)錄因子MYC2啟動(dòng)并級(jí)聯(lián)放大茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而防御病蟲侵害,但防御反應(yīng)過度發(fā)生時(shí)則會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。因此,茉莉酸信號(hào)的適時(shí)消減對(duì)于植物完成正常生命周期至關(guān)重要。然而,目前人們對(duì)茉莉酸信號(hào)途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)主要集中在MYC2如何激活茉莉酸響應(yīng)基因的表達(dá)方面,對(duì)于茉莉酸響應(yīng)基因表達(dá)消減的機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺。本論文以番茄為材料,研究茉莉酸信號(hào)的消減機(jī)制,不僅對(duì)闡明茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要的科學(xué)意義,而且有助于建立一種依賴植物自身抗性的環(huán)境友好型的農(nóng)業(yè)病蟲害防治策略,以降低農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失,因而具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)番茄MYC2激活一類茉莉酸誘導(dǎo)的bHLH類型轉(zhuǎn)錄因子,MYC2-TARGETEDBHLH 1(MTB1),MTB2 和 MTB3,而 MTB1-3 抑制 MYC2 介導(dǎo)的茉莉酸響應(yīng)基因的表達(dá),從而形成負(fù)反饋調(diào)控通路,實(shí)現(xiàn)茉莉酸信號(hào)的消減。主要研究結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄共激活因子MED25和轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ7競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合MYC2。酵母雙雜交和pull-down實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)和體外證明MYC2通過含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的N-端與MED25互作,已有研究證明MYC2通過相同的區(qū)段與JAZ蛋白互作。酵母三雜交實(shí)驗(yàn)和pull-down實(shí)驗(yàn)證明MED25和JAZ7競(jìng)爭(zhēng)性地與MYC2互作。暗示著JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的本質(zhì)是MYC2通過結(jié)合不同的互作蛋白(轉(zhuǎn)錄共激活因子MED25或轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制功能,從而介導(dǎo)JA響應(yīng)基因的激活或抑制。2.MYC2直接調(diào)控MYC2-likebHLH類型轉(zhuǎn)錄因子MTB1-3的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和凝膠阻滯遷移實(shí)驗(yàn)表明MYC2直接結(jié)合MTB1-3的啟動(dòng)子區(qū)G-box基序。機(jī)械損傷可以誘導(dǎo)MTB1-3的表達(dá),且這種誘導(dǎo)依賴于MYC2和MED25。3.通過構(gòu)建MTB過表達(dá)(MTB1-OE)和低表達(dá)(MTB-RNAi)轉(zhuǎn)基因材料,并檢測(cè)這些材料中機(jī)械損傷和茉莉酸誘導(dǎo)的抗性基因表達(dá),茉莉酸誘導(dǎo)的花青素積累和根長(zhǎng)抑制,以及對(duì)昆蟲和病原菌的抗性,發(fā)現(xiàn)MTB負(fù)向調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的響應(yīng)。4.序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),與MYC2相比,MTB1-3的C-端(含bHLH結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)形成同源、異源二聚體和結(jié)合DNA)比較保守,同源性高達(dá)92.75%;N-端(含轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)與轉(zhuǎn)錄共激活因子MED25和轉(zhuǎn)錄共抑制因子JAZ互作)保守性較低,同源性僅為38.18%。MTB1可以與MYC2形成異源二聚體,并與MYC2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的靶標(biāo)基因啟動(dòng)子。MYC2能同時(shí)與MED25和JAZs互作,兼具轉(zhuǎn)錄激活功能和轉(zhuǎn)錄抑制功能,而MTB1-3只與JAZs互作,只具備轉(zhuǎn)錄抑制功能。MTB1-3 一方面通過與MYC2結(jié)合相同位點(diǎn),降低MYC2對(duì)靶標(biāo)基因啟動(dòng)子DNA的結(jié)合,從而抑制MYC2靶標(biāo)基因的表達(dá);另一方面,MTB1-3干擾MED25-MYC2的互作,影響MYC2-MED25功能復(fù)合體的形成,從而抑制MYC2的轉(zhuǎn)錄激活活性。5.由于MTB1-3負(fù)向調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的防御反應(yīng),我們利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),對(duì)MTB1和MTB2基因進(jìn)行編輯并獲得功能缺失突變體mtb1-c和mtb1 mtb2-c。表型分析發(fā)現(xiàn),mtb1-c和mtb1 mtb2-c提高了對(duì)昆蟲的抗性而不影響生長(zhǎng)發(fā)育,表明MTB1-3在番茄抗性機(jī)制研究和番茄育種中均有較大的應(yīng)用價(jià)值。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)MTB1-3是茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)控因子,通過抑制核心轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體MYC2-MED25的功能發(fā)揮消減茉莉酸信號(hào)的作用,作為“剎車”精細(xì)調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)反應(yīng)強(qiáng)度,降低防衛(wèi)反應(yīng)過度對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的抑制,從而更好地調(diào)控植物抗性反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育之間的平衡。本研究不僅深化了我們對(duì)植物激素茉莉酸介導(dǎo)的防御反應(yīng)調(diào)控機(jī)制的理解,還構(gòu)建了抗蟲能力高而生長(zhǎng)發(fā)育不受影響的番茄株系,為通過分子育種培育抗病新品種提供了重要的理論基礎(chǔ)和研究材料。
【圖文】：

酸的生物合成途徑（Ｚｈａｉｅｔａｌ．，２０１７ｂ）。逡逑Ｔｈｅ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ＪＡｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋（Ｚｈａｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１７ｂ）．逡逑屬于不飽和脂肪酸衍生物，是由其前體亞麻酸（ａ－Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ邋ａｃｉｄ）．邋ＡＬＡ）（ｔｈｅｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ）合成。整個(gè)過程大體可以分成兩個(gè)階段：一是合成１２－ＯＰＤＡ，這一過程包括在響應(yīng)信號(hào)剌激下，磷酸脂酶Ａｌ（Ｐｈｏｓｐｈｏ將ＡＬＡ從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體膜上解離，經(jīng)１３－脂氧化酶（１３－Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ，，１３－ＬＯ（Ａｌｌｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ邋ｓｙｓｔｈａｓｅ，邋ＡＯＳ），丙二稀環(huán)化酶（Ａｌｌｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ，邋ＡＯＣ）間產(chǎn)物１２－ＯＰＤＡ。因?yàn)樵撓盗忻福ǎ保常蹋希�、ＡＯＳ，ＡＯＣ）均定位于葉綠體，成的初始步驟（從ＡＬＡ到１２－ＯＰＤＡ）發(fā)生在葉綠體中；二是１２－ＯＰＤＡ在成最終產(chǎn)物茉莉酸。在過氧化物酶體中，１２－ＯＰＤＡ經(jīng)還原酶（ＯＰＤＡ邋ｒｅｄ成（＾（：－８：0，在�；o酶氧化酶（八0￥１－（：0八（＾也５￡丨，八0＼丨）的作用下，經(jīng)終產(chǎn)物茉莉酸。逡逑

圖１．２茉莉酸的衍生物和代謝（Ｚｈａｉｅｔａｌ．，２０１７ｂ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ邋ｏｆ邋ｊａｓｍｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ邋（ＪＡ）邋（Ｚｈａｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１７ｂ）．逡逑植物在不同的脅迫響應(yīng)和不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，會(huì)通過不同的途徑將ＪＡ代謝成活性逡逑的、部分活性的或沒有活性的組分，以平衡ＪＡ的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，如結(jié)合氨基酸、氫化、羧化、逡逑脫羧、甲基化、酯化、磺化、糖基化和形成１２－ＯＨ－ＪＡ內(nèi)酯等。逡逑１．２．５．１茉莉酸氨基酸合成酶ＪＡＲ１逡逑以及／邋0／ＡＳＭ９ＡＭｒ／＾５／７｝ｌＡＴ／）編碼一個(gè)ＡＴＰ依賴的ＪＡ－氨基酸合成酶，是一種酰腺逡逑苷形成焚光素合成酶，屬于ＧＨ３基因家族，主要發(fā)揮�；岚访福ǎ幔悖戾澹幔悖椋洌幔恚椋洌镥义希螅睿簦瑁澹簦幔螅澹┳饔茫ǎ龋螅椋澹瑁澹翦澹幔臁卞澹玻埃埃埃诲澹樱瑁澹颍疱澹澹翦澹幔欤�，２０１８；邋Ｓｔａｓｗｉｃｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２；邋Ｓｕｚａ邋ａｎｄ邋Ｓｔａｓｗｉｃｋ，逡逑２００８）。ＡｔＣＨ３．ｌｌ是擬南芥中的一個(gè)�；岚访�，ＡｔＣＨ３．ｌｌ的特定底物是ＪＡ，其產(chǎn)物（３Ｒ，逡逑７Ｓ）－ｊａｓｍｏｎｏｙｌ－Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ邋（ＪＡ－Ｉｌｅ）是具有最高生物活性的邋ＪＡ邋組分（Ｓｔａｓｗｉｃｋ邋ａｎｄ邋Ｔｉｒｙａｋｉ，逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S641.2


本文編號(hào)：2634530