【摘要】：乙烯作為一種重要的植物激素,廣泛地參與植物器官形態(tài)建成、衰老脫落、開花成熟以及對逆境脅迫的響應等生理生化進程。microRNA(miRNA)可通過靶向激素合成、受體及信號轉導關鍵基因,參與植物體內(nèi)激素的應答調(diào)節(jié)。因此,研究miRNA在乙烯誘導的番茄花柄脫落中的作用,將為明確番茄中miRNA調(diào)控乙烯應答調(diào)節(jié)及完善乙烯誘導番茄花柄脫落的分子機制提供理論依據(jù)。本研究以"中蔬6號"番茄離體花柄為試材,通過構建脫落前期(0-4 h)和后期(8-32 h)的small RNA(sRNA)和降解組測序文庫,篩選出番茄花柄脫落相關miRNA及其靶基因,對關鍵miRNA(Sly-miR1917)進行超量表達功能驗證,以及關鍵miRNA和靶基因的時空表達模式分析,目的是明確miRNA參與番茄花柄脫落等乙烯相關反應的分子機制,并探討選擇性剪接、miRNA降解等轉錄后水平調(diào)控的發(fā)生對乙烯信號應答調(diào)節(jié)的意義。主要研究結果如下:1.明確參與番茄花柄脫落的miRNA及其靶基因,并篩選出參與脫落的關鍵miRNA(Sly-miR1917)。結果顯示:在番茄花柄脫落進程中共檢測到56個已知miRNA和11個新增miRNA的表達,223個靶基因發(fā)生降解;這些靶基因主要在細胞膜組分富集,具有結合功能和催化活性,參與代謝通路、植物病原體相互作用及植物激素信號轉導;在番茄花柄脫落不同階段,miRNA的表達模式和對靶基因的調(diào)控模式有所不同,并會受到乙烯處理的影響,表明在番茄花柄脫落進程中miRNA和靶基因之間存在著復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。2.明確Sly-miR1917參與番茄乙烯反應的機制。結果顯示:Sly-miR1917和SlCTR4svs在器官形態(tài)建成、果實發(fā)育成熟及花柄中表達模式呈負相關;超表達Sly-miR1917株系黃化苗表現(xiàn)出加強的三重反應,成株葉片偏上性生長,花柄提前脫落,果實成熟加速;超表達Sly-miR191 7株系中CTR下游乙烯信號轉導元件表達水平顯著上調(diào),VIGS誘導超表達Sly-miR1917植株中EIN2的基因沉默,能夠?qū)⒎鸦ū撀渎式档椭烈吧头阉?表明Sly-miR1917能夠通過負調(diào)控靶基因SlCTR4svs改變乙烯信號通路,從而參與番茄乙烯反應調(diào)控。3.明確番茄花柄脫落進程中Sly-miR1917對其靶基因的調(diào)控模式,以及靶基因?qū)ly-miR1917的反饋調(diào)節(jié)。結果顯示:外顯子跳躍和受體位點的改變,導致SlCTR4基因形成3個具有Sly-miR1917結合位點的選擇性剪接體,其編碼蛋白亞型與S1CTR4同為一簇,且與潘那利番茄、馬鈴薯、辣椒CTR蛋白有較高同源性;SlCTR4sv1-3在番茄花柄脫落進程中表現(xiàn)出不同的表達模式,其中SlCTR4sv3與Sly-miR1917的時空表達模式互補,且SlCTR4sv3在花柄的分布有很強的離區(qū)特異性,表明SlCTR4sv3可能是在花柄脫落進程中受Sly-miR1917負調(diào)控的關鍵靶基因;在抗Sly-miR1917降解的35S:mSlCTR4sv3轉基因株系中SlCTR4sv3的表達量顯著高于野生型番茄,且高于未突變的35S::SlCTR4sv3,說明SlCTR4sv3表達水平受到Sly-miR1917的嚴格調(diào)控,此外,SlCTR4sv3的高表達會誘導Sly-miR1917的表達量上調(diào),這一現(xiàn)象在35S::mSlCTR4sv3株系中尤為明顯,暗示著SlCTR4sv3能夠反饋調(diào)節(jié)Sly-miR1917的表達。4.明確基于Sly-miR1917調(diào)控的乙烯信號參與2,4-D的作用機制。結果表明:2,4-D處理能夠顯著上調(diào)番茄AUX/IAA家族成員SlIAA15和SlIAA29的表達水平,Sly-miR1917的表達無顯著變化,而靶基因SlCTR4svs顯著上調(diào),SlCTR4sv3極顯著上調(diào);反義SlIAA29植株無明顯表型變化,反義SlIAA15導致植株矮化、頂端優(yōu)勢減弱、葉柄復生小葉,表明SlIAA15可能參與生長素和乙烯信號的交叉路徑,35S::SlIAA15表現(xiàn)出2,4-D傷害的表型;35S::ly-miR1917、35S::SlCTR4sv3 和 35S::mSlCTR4sv3 轉基因株系對 2,4-D 處理的敏感性不變,暗示著乙烯可能通過其他方面的調(diào)控參與2,4-D作用機理。
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第一章前言逡逑模式和功能各不相同（Ｙｉｎｇ邋ｅｔ址，１９９９；邋Ｔｕ濁ｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０）。ＡＣＳ是己^0生物關鍵限速酶片１１３１巧６１３１．，，２０１２）。研究表明，果實成熟作}0化６１３１．，２０（）３）、機邋ｅｔ邋ａｌ．，２０００；邋Ｏｗｉｎｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２）、植物激素生長素（Ｔａｔｓｕｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０巧和細胞ｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００３）等會誘導基因表達，進而影響植株乙^0釋放量。逡逑乙榅信號傳導路徑逡逑乙稀在植物體內(nèi)的作用受其生物合成、受體感知和信號轉導３個方面影響。向遺傳學和分子生物學手段對模式植物擬南芥的研究，克隆出乙稀合成及遞途徑中的相關基因并進行功能分析，構建出一條線型的乙稀信號代謝模０１２；邋Ａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０；邋Ｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３）（圖邋１－１）。逡逑

邐．ｒｉＴｒ＾邐ｉ逡逑圖１－１擬南芥乙Zf信號轉導模式圖（引自Ｙａｎｇ，２０１５）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｅｔｈｙｌｅｎｅ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋（Ｙａｎｇ，邋２０１５）逡逑己痛分子首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體家族所感知。在擬南芥中克隆得到５個乙Zf受體逡逑基因，分別為邋ＥＴＲ１邋（ｅｔｈｙｌｅｎｔ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋１）、ＥＴＲ２、ＥＩＮ４邋（ｅ出ｙｌｅｎｅ邋ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ邋４）、ＥＲＳ１逡逑（ｅｔｈｙｌｅｎｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｅｎｓｏｒ邋１巧口邋ＥＲＳ２邋（Ｈｕａ邋ａｎｄ邋Ｍ巧ｅｒｏｗｉｚ，１９９８邋ａ，ｂ）。乙Zf受體包含氨基端逡逑信號感受結構域、摟基端組氨酸激酶結構域和反應調(diào)控結構域。受體是乙^0信號的負調(diào)逡逑控因子，在銅離子的參與下，己稀與受體的結合會使受體失活（Ｍａｓｕｄａ，邋１９８７）ＤＣｈｅｎ邋口００７）逡逑指出ＥＴＲ２失活的機制是被泛素２化蛋白酶降解。根據(jù)氨基端疏水區(qū)結構域個數(shù)的不同，逡逑高等植物藝稀受體可分為兩個子類：ＥＴＲｌ－ｌｉｋｅ（３個）和ＥＴＲ２－ｌｉｋｅ（４個）（Ｈｕａ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９％逡逑ａ）。目前
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S641.2

【參考文獻】

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本文編號：2632702