【摘要】：日本結(jié)縷草(Zoysia japonica)是非常重要的草坪草,耐逆性強、管理粗放及觀賞性高等特點使得它被廣泛應用于各種草坪的建植中。目前,己經(jīng)有了大量關于結(jié)縷草的研究報道,包括優(yōu)良品種選育、耐鹽與耐低溫的研究、病害防治的研究、分子標記的開發(fā)等等。結(jié)縷草的優(yōu)良品質(zhì)與根際環(huán)境中的微生物作用有很大的關系,然而,目前對結(jié)縷草耐鹽性及根系微生物的研究還相對較少。因此,本項研究利用二代高通量測序的手段在兩方面對結(jié)縷草的耐鹽性進行研究。第一部分內(nèi)容的研究是通過高通量測序獲得大量根際真菌的基因信息,為以后篩選菌株研究真菌增強結(jié)縷草耐鹽性提供研究基礎;第二部分內(nèi)容是獲得大量結(jié)縷草耐鹽候選基因,為結(jié)縷草本身耐鹽的研究提供工作基礎。研究的主要結(jié)果如下:1.通過Illumina的HiSeqTM2000測序平臺,測得自然狀態(tài)下生長的結(jié)縷草根系及根際微生物轉(zhuǎn)錄組。共獲得5.49 Gb的數(shù)據(jù)量,拼接和組裝后共得到了 68,024個unigenes,平均長度為 802.07 bp,N50 的長度為 1,193 bp。通過與 NR、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對,分別獲得了 49,334和30,159個注釋的unigenes。在總unigenes中,分離出了 28,284條結(jié)縷草unigenes序列,同源性分析發(fā)現(xiàn),結(jié)縷草的親緣物種依次是谷子、高粱、玉米和水稻。基因功能注釋的結(jié)果發(fā)現(xiàn),18,719條unigenes富集在53個GO亞分類中,10,300條unigenes富集在了 24個COG分類中。KEGG注釋中,有7,555條unigenes富集在124條代謝通路上。在總unigenes中,分離出了 18,889條真菌序列。在這些真菌里,有29種真菌的unigenes數(shù)超過了 100條,其中unigenes數(shù)最多的是Rhizophagusirregularis,兩個亞種共包含4,074個unigenes。2.結(jié)縷草鹽脅迫處理后的DAB染色法分析發(fā)現(xiàn),10分鐘內(nèi),根系表面就被誘導出了過氧化氫,到了 30分鐘后,根系內(nèi)部也充滿了過氧化氫,說明ROS相關代謝途徑已經(jīng)被啟動。對結(jié)縷草基因ZjNHX1進行半定量表達分析,發(fā)現(xiàn)該基因的表達量在20分鐘的時間內(nèi)出現(xiàn)了顯著性上調(diào),直到處理后2小時,該基因的表達量都顯著高于處理前,說明SOS的代謝途徑也正參與調(diào)控。20分鐘時,ROS和SOS相關代謝途徑被啟動,因此,選取該時間點進行取樣。3.對對照組(CK)和鹽脅迫處理組(Case)分別進行轉(zhuǎn)錄組測序,混合拼接后共獲得32,849條unigenes,平均長度為1,107 bp,N50為1,781 bp�；赗PKM的值分析,在兩個文庫中找到了 1,648個差異表達的unigenes,有948個unigenes表達上調(diào),700個unigenes表達量下調(diào)。GO分類發(fā)現(xiàn),1,455個差異基因富集在了 73個亞類中,并且67個亞類屬于生化進程。近緣物種的耐鹽基因比對分析表明,結(jié)縷草的耐鹽調(diào)控方式與水稻和谷子更為接近。4.基于測序拼接獲得的unigenes中,共預測到了 2,690個轉(zhuǎn)錄因子,隸屬于80個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中,成員數(shù)最多是AP2/EREBP家族,有187個,其次是bHLH家族和WRKY家族,分別為158個和137個。5.本實驗在結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組研究的基礎上,克隆出了一個NAC類基因。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因序列包含1個完整的開放閱讀框,長度為1,332 bp,編碼了 449個氨基酸,包含一個NAM結(jié)構域。實時熒光定量PCR結(jié)果表明該基因會受到干旱、高鹽及低溫脅迫誘導,可能是脅迫反應中的重要基因。
【圖文】：

結(jié)縷草在自然狀態(tài)下生長，根際周圍會存在很多的微生物，包括細菌、真菌、節(jié)逡逑肢動物等等。結(jié)縷草的健康的生長離不開這些微生物的作用。因此，為研宄結(jié)縷草和逡逑微生物作用，我們必須將它們的序列與其他生物的序列分開。首先，分離結(jié)縷草的基逡逑因序列。下載邋ＮＣＢＩ邋（Ｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｅｎｔｅｒ邋ｆｏｒ邋Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中植物基因的數(shù)逡逑據(jù)庫，將所有ｉｍｉｇｅｎｅｓ和該數(shù)據(jù)庫比對，被注釋的ｕｎｉｇｅｎｅｓ可以認為是結(jié)縷草的，逡逑這部分序列數(shù)據(jù)稱為Ｚ１。再將剩下的ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列與己有的結(jié)縷草數(shù)據(jù)庫（Ａｈｎ邋ｅｔ邋ａｌ，逡逑２０１５）進行比對，得到了新的一部分ｉｍｉｇｅｎｅｓ序列，稱為Ｚ２。將這兩次比對的到的逡逑ｕｎｉｇｅｎｅｓ，Ｚ１和Ｚ２合并，就獲得了本次結(jié)縷草測序的所有ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列。接著，開逡逑始分罔真菌的序列。將剩余的ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列（除去Ｚ１和Ｚ２的所有ｕｎｉｇｅｎｅｓ）與ＮＣＢＩ逡逑的真菌數(shù)據(jù)庫進行比對分析，得到了真菌的ｉｍｉｇｅｎｅｓ序列。共得到了邋２８，２８４條結(jié)縷逡逑草的序列和１８，８９９條真菌序列。逡逑２．邋２．邋４．邋２．結(jié)縷草序列的ＮＲ注釋逡逑ＮＲ注釋的具體信息如下表所示。對結(jié)縷草的基因，我們做了進化分析，結(jié)果如逡逑下圖，最相似的的物種是谷子有１１，４９６條序列與該物種親緣性高，逡逑其次是高粱削６／ｃｏ／ｏｒ）和玉米（Ｚｅａ佭；Ａ？）分別有４，４４５和４，，４２１條親緣序列。逡逑

圖２－２：真菌種類分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｓｐｅｃｉｅｓ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ逡逑表２－５：邋ｕｎｉｇｅｎｅｓ數(shù)超過１００的真菌逡逑
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S688.4

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本文編號：2627980