發(fā)布時間：2020-04-08 21:01

【摘要】：疫霉菌(Phytophthora)能侵染幾乎所有的雙子葉植物,對農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害。辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和大豆疫霉(Phytophthora sojae)是其重要成員。病原卵菌在侵染宿主植物時會分泌大量的效應(yīng)子來促進侵染,這些效應(yīng)子主要包括RxLR和CRN兩大類。本研究通過對辣椒疫霉6個RxLR效應(yīng)子和大豆疫霉1個CRN效應(yīng)子進行功能分析,初步揭示了這些效應(yīng)子在致病中的作用。本研究主要獲得如下結(jié)果:辣椒疫霉中RxLR242同源基因的鑒定與功能分析:辣椒疫霉中單個RxLR效應(yīng)子與寄主和非寄主的互作情況少有報道。前期的結(jié)果表明,RxLR242能引起細胞壞死;沉默RxLR242提高了辣椒疫霉對寄主植物本氏煙的侵染能力,且能侵染非寄主植物普通煙。本研究在辣椒疫霉3個不同的菌株中共鑒定到14種RxLR242的同源基因,但是它們只編碼7種RxLR242蛋白。隨后在本氏煙和普通煙中分別瞬時表達這7種蛋白,發(fā)現(xiàn)其中5種能誘導(dǎo)細胞死亡,2種不能。同時,通過蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)7種同源蛋白表現(xiàn)出誘導(dǎo)細胞壞死活性的分化可能是由于第101位氨基酸由亮氨酸(L)突變成精氨酸(R)所致。進一步研究發(fā)現(xiàn),2種不能誘導(dǎo)細胞死亡的蛋白能抑制其他5種蛋白所誘導(dǎo)的細胞死亡。以上結(jié)果說明,RxLR242在辣椒疫霉不同菌株中存在多態(tài)性;不同RxLR242同源物之間存在誘導(dǎo)細胞死亡活性的分化,并且這種分化可能是由于單個氨基酸突變所致;不能誘導(dǎo)細胞死亡的同源物蛋白有抑制誘導(dǎo)的細胞死亡的活性。辣椒疫霉中5個RxLR效應(yīng)子的功能研究:辣椒疫霉中RxLR效應(yīng)子在辣椒疫霉中的毒性功能尚不清楚。前期通過煙草瞬時表達發(fā)現(xiàn)RxLR22、RxLR25和RxLR103能引起細胞壞死,同時利用酵母雙雜系統(tǒng)鑒定出RxLR103、RxLR172能與抗性相關(guān)蛋白互作。為了檢測這些基因?qū)苯芬呙苟拘缘挠绊?通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法對上述基因進行沉默,進一步通過致病性分析和菌絲定殖檢測發(fā)現(xiàn),沉默這5個基因都顯著降低了辣椒疫霉的致病力。以上結(jié)果說明,辣椒疫霉中的5個RxLR基因在辣椒疫霉侵染宿主植物的過程中發(fā)揮著毒性功能。PsCRN161通過上調(diào)表達抗性相關(guān)基因來提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性:本研究前期證明,大豆疫霉中的PsCRN161具有細胞死亡抑制活性,PsCRN161定位在宿主植物細胞核,PsCRN161轉(zhuǎn)基因植株抗病性以及耐旱、耐鹽的能力有所提高。但是其分子機制依然不清楚,為了解析其分子機制,本研究通過數(shù)字基因表達譜分析發(fā)現(xiàn),PsCRN161轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)一系列抗性相關(guān)的差異表達基因,包括ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因、細胞素P450基因和細胞受體類激酶(RLK)基因等,選取其中有代表性的基因進行定量檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與數(shù)字基因表達譜相似,這些抗性相關(guān)基因在PsCRN161轉(zhuǎn)基因植株中顯著上調(diào)表達。以上結(jié)果說明PsCRN161可能是通過正向調(diào)控抗性相關(guān)基因來的表達來提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性。
【圖文】：

由于沉默轉(zhuǎn)化子存在恢復(fù)的風(fēng)險，所以采用實時定量ＰＣＲ的方法重驗Ｍａｆｕｒａｈ逡逑獲得的３個兄的轉(zhuǎn)化子，包括１個未沉默轉(zhuǎn)化子和２個沉默轉(zhuǎn)化子。三次生逡逑物學(xué)重復(fù)驗證后，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)化子Ｔ２９依然是沉默的，沉默效率為６０％邋（圖２－２Ａ）；逡逑Ｔ２９與之前比沉默效率有所上升，其余２個轉(zhuǎn)化子的表達量要明顯高于辣椒疫霉野生逡逑型ＬＴ２６３。因此，轉(zhuǎn)化子Ｔ２９是基因ＲＸＬＲ２４２的沉默轉(zhuǎn)化子。逡逑前期研究證明沉默／ＬＹＩＸ２７２基因能提高辣椒疫霉對植物的致病力（Ｍａｆｕｒａｈ邋ｅｔ邋ａｌ．逡逑２０１４）。我們將沉默轉(zhuǎn)化子Ｔ２９和辣椒疫霉野生型分別接種在本氏煙左右兩邊相同的逡逑位置，３６小時后紫外燈下拍照并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。三次生物學(xué)重復(fù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子逡逑Ｔ２９在本氏煙上引起的病斑要明顯大于野生型所引起的病斑（圖２－２邋Ｂ，Ｄ）。為了進逡逑一步證明結(jié)果的可靠性，對沉默轉(zhuǎn)化子Ｔ２９和辣椒疫霉野生型接種點的菌絲定植量進逡逑行檢測。定量ＰＣＲ的結(jié)果顯示，沉默轉(zhuǎn)化子Ｔ２９在煙草葉片中的菌絲含量要顯著高逡逑于辣椒疫霉野生型的菌絲含量（圖２－２邋Ｃ）。因此

在ＬＴ２．６３中有８種不同序列，ＬＴ５１和ＰＣ３５中有各有４種不同的序列（表２－５）。通逡逑過序列對比發(fā)現(xiàn)，這１４種序列的相似度超過８５％，同個菌株內(nèi)相似度更高，特別是逡逑在ＬＴ５１和ＰＣ３５這２個菌株內(nèi)部達到９５％以上（圖２－４，２－５，２－６），在ＬＴ２６３菌株中逡逑序列和與其他６種序列差別最大。逡逑由于序列相似度極高，所以根本無法用引物擴增的方法將其一一區(qū)分，于是根逡逑據(jù)序列的保守區(qū)段設(shè)計出了能檢測所有同源基因的定量引物（表２－１）。逡逑通過熒光定量ＰＣＲ的方法分別檢測了辣椒疫霉３個菌株中所有同源基因在逡逑不同侵染階段的表達情況。發(fā)現(xiàn)基因的表達模式在辣椒疫霉３個菌株中的趨逡逑勢相似，都表現(xiàn)為侵染前期大幅度上調(diào)表達且表達量達到最大值，中后期表達量下調(diào)；逡逑但是不同菌株在相同侵染階段的表達量差異顯著，表現(xiàn)為在ＬＴ２６３中表達量最高、逡逑ＰＣ３５次之、ＬＴ５１最低（圖２－３）。逡逑進一步分析發(fā)現(xiàn)，這１４種不同的基因序列只編碼７種不同的蛋白序列，其中將逡逑Ｍａｆｂｒａｈ等報道的效應(yīng)蛋白（ＭａｆＵｒａｈｅｔａｌ．２０１４）編號為ＲｘＬＲ２４２－７。這些逡逑蛋白序列在不同的菌株中的分布也是有差異的，ＬＴ２６３菌株中最多有６種，ＬＴ５１中逡逑有４種，ＰＣ３５中有３種；其中有３種蛋白序列是３個菌株共有的分別為ＲｘＬＲ２４２－ｌ、逡逑ＲｘＬＲ２４２－２、ＲｘＬＲ２４２－３，，邋３邋種是邋ＬＴ２６３邋菌株中獨有的分別為邋ＲｘＬＲ２４２－４、ＲｘＬＲ２４２－５、逡逑ＲｘＬＲ２４２－７
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.418.1;S435.651

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