【摘要】：占我國蘋果栽培面積70%的‘富士’品種成花難、大小年結(jié)果現(xiàn)象普遍發(fā)生,是產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的關(guān)鍵瓶頸問題之一。GA具有抑制蘋果等木本植物成花的效應(yīng),蘋果花芽孕育及大小年形成與幼果種子中合成的GA調(diào)控密切相關(guān),相關(guān)調(diào)控機制有待深入解析。本研究通過對蘋果赤霉素合成通路中的氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox進行全基因組鑒定與分析,測定其表達模式,篩選參與花芽孕育調(diào)控的候選基因,并進行克隆與分析;同時對GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的MdGAMYB基因的表達模式、基因和啟動子克隆序列、外源轉(zhuǎn)化番茄的功能及互作蛋白進行研究分析。主要結(jié)果如下:1、蘋果赤霉素氧化酶家族成員鑒定、進化、表達特性及候選成員的克隆。(1)從蘋果基因組里鑒定出41個赤霉素氧化酶基因,其中GA2ox類20個,GA3ox類14個,GA20ox類7個;蘋果表達量數(shù)據(jù)庫組織特異性分析發(fā)現(xiàn)其在不同品種不同組織部位差異表達,其中花和果實中高表達。(2)結(jié)合生物信息學和‘長富2號’花芽孕育過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,挑選出8個表達較高的基因MdGA2ox4/6/9/12,MdGA3ox5/12和MdGA20ox1/5。GA_3處理后,花芽孕育不同時期GA20ox類氧化酶基因表達均下調(diào),GA2ox類氧化酶基因表達均上調(diào),GA3ox類氧化酶基因表達模式不一致,基本符合負反饋調(diào)節(jié)機制。PAC處理后,這3類基因表達整體下調(diào),大部分基因表達不符合負反饋調(diào)節(jié)機制。(3)克隆了‘長富2號’和‘煙富6號’的MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5基因,序列比對發(fā)現(xiàn),2個品種中MdGA2ox9和MdGA20ox5的堿基序列完全一致,而MdGA3ox12基因在‘煙富6號’中克隆得到兩種序列,存在2個氨基酸的突變,第66個氨基酸由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L),第137個氨基酸由精氨酸(R)突變?yōu)楦拾彼?G),且突變發(fā)生在的保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域。(4)對3個基因MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5表達分析顯示,這3個基因在不同組織中均有表達,MdGA2ox9和MdGA20ox5在花和芽中表達都相對較高;在難成花的‘長富2號’中赤霉素合成類的基因MdGA20ox5和MdGA3ox12較易成花‘煙富6號’表達更高,相反分解類基因MdGA2ox9則在‘長富2號’中表達較低;不同大小年花芽中,MdGA3ox12和MdGA20ox5在大年芽中均高于小年芽,MdGA2ox9則相反。這些結(jié)果暗示了它們可能參與蘋果的花芽孕育和大小年調(diào)控。2、MdGAMYB基因編碼區(qū)和啟動子序列克隆,表達特性和功能分析。(1)克隆了蘋果6個成花特性不同的栽培品種和2個砧木材料的MdGAMYB的序列,結(jié)果顯示:8份材料中MdGAMYB的基因序列存在差異,蛋白比對結(jié)果顯示,保守區(qū)域未發(fā)生較大差異�？寺×�3個成花特性不同的蘋果品種的MdGAMYB啟動子序列,結(jié)果顯示‘秦冠’與‘富士’品種(‘煙富6號’和‘玉華早富’)存在較大片段差異,啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),在不同品種中也出現(xiàn)了激素響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件的差異。(2)表達模式分析發(fā)現(xiàn),MdGAMYB在葉、花和芽中表達量較高;GA_3處理后,MdGAMYB的表達受到了顯著抑制,在PAC處理后,則呈現(xiàn)相反趨勢;在難成花的‘長富2號’中表達顯著低于易成花的‘煙富6號’;在‘長富2號’大年、小年花芽中沒有明顯的趨勢。這些結(jié)果表明MdGAMYB受GA的負調(diào)控,可能參與蘋果花芽孕育。(3)在番茄中異源過表達MdGAMYB。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達MdGAMYB轉(zhuǎn)基因陽性番茄株系開花時間相較于野生型提前,且過表達陽性株系中與番茄花芽孕育相關(guān)基因的表達也受到顯著的影響。為探討MdGAMYB調(diào)控單性結(jié)實的功能,對蘋果進行單性結(jié)實處理,結(jié)果表明在GA_(4+7)處理后15 d內(nèi),MdGAMYB的表達量顯著低于授粉對照。處理后120 d的幼果中MdGAMYB的表達量顯著高于授粉對照。3、MdGAMYB的酵母雙雜交篩庫獲得39個陽性結(jié)果,經(jīng)過序列比對和功能預(yù)測,獲得3個激素相關(guān)的基因,3個在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能的基因和9個功能酶蛋白。
【圖文】：

已經(jīng)總結(jié)出了調(diào)控植物開花的6條途徑，包括：春化、自主、年齡、光周期、溫敏、赤霉素途徑（Mouradovet al. 2002）。這6條途徑之間彼此獨立又互相聯(lián)系，形成了復(fù)雜精密的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（張藝能 等 2014）（圖1-1 ）。植物經(jīng)過 系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)控關(guān)鍵成花基因的表達從而實現(xiàn)對開花時間、數(shù)量、質(zhì)量等方面的控制。圖 1-1 擬南芥成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖（張藝能 等 2014）Fig. 1-1 Schematic diagram of Arabidopsis flowering regulation network（張藝能 等 2014）

西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文4圖1-2 擬南芥中GA調(diào)控的成花途徑（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）Fig. 1-2 Flowering pathways regulated by GA in Arabidopsis（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）1.2 蘋果花芽分化研究進展蘋果花芽分化是形成果實的基礎(chǔ)，花芽形成的質(zhì)量對果實的品質(zhì)、數(shù)量等具有重要的影響，花芽分化過程受內(nèi)在（樹體的營養(yǎng)基礎(chǔ)、激素水平等）和外在（溫度、氣候等環(huán)境因素）等各種因素的影響（李燁 2009）。因此加強對蘋果花芽分化的研究具有重要的意義。1.2.1 蘋果花芽分化過程蘋果的花芽分化過程比較復(fù)雜，，周期較長，從春梢停長前后，到翌年開花前 直在進行，主要包括3個時期：生理分化期、形態(tài)分化期以及花芽進 步發(fā)育期（性細胞形成期）（潘換來 2018）。其中生理分化期是蘋果花芽形成的關(guān)鍵時期，在這時期芽的生長點發(fā)生了生理上的質(zhì)變，是芽體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)折期，決定能否形成花芽，因此又被稱作‘花芽孕育臨界期’（潘換來 2018）。這 關(guān)鍵時期起始于新梢長出頂芽或腋花芽后，枝條停止生長時，終止于花芽形態(tài)分化期開始之前（曹尚銀 等2001）
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S661.1

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本文編號：2607704