【摘要】：葡萄(Vitis L.)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)類果樹作物之一,目前生產(chǎn)上廣泛栽培種以歐洲葡萄品種為主,其品質(zhì)優(yōu)良,但抗逆性普遍較差。冷(凍)害是限制葡萄生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一,嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量與品質(zhì),已成為我國北方寒地葡萄栽培中亟待解決的重要問題。山葡萄是葡萄屬植物中抗寒性最強的種,并已成為世界葡萄抗寒育種的重要種質(zhì)資源。Ca2+介導(dǎo)的CBL-CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物參與脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一些成員的功能相繼在模式植物擬南芥、水稻中被報道,然而有關(guān)葡萄屬植物CBL、CIPK家族成員參與逆境脅迫響應(yīng)的功能研究較少。本研究通過挖掘抗寒種質(zhì)山葡萄CBL-CIPK家族中的關(guān)鍵成員,研究了 VaCBL01和VaCIPK02基因參與逆境脅迫的表達(dá)模式、定位、互作蛋白,以及參與逆境脅迫的功能特點。主要結(jié)果如下:1、山葡萄VaCBL01基因表達(dá)特性及與VaCIPKs蛋白互作分析。VaCBLL01在山葡萄根、嫩梢、卷須、花絮及幼葉中為組成型表達(dá),卷須中具有較高的表達(dá)量。VaCBL01受ABA誘導(dǎo)表達(dá),在12 h表達(dá)量較高,隨后呈下調(diào)表達(dá);VaCBL01受4℃低溫脅迫誘導(dǎo)呈下調(diào)表達(dá)。VaCBL01與19個山葡萄VaCIPKs蛋白之間的相互作用的特異性和強度不同:VaCBL01與山葡萄12個CIPKs有強烈的互作;與5個CIPKs互作強度較弱,與2個CIPKs不互作,表明VaCBL01在解碼Ca2+信號及形成CBL01-CIPKs復(fù)合體后轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的過程中起到重要作用。2、山葡萄VaCIPK02基因表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性、互作蛋白篩選與鑒定。VaCIPKK02在山葡萄不同組織中為組成型表達(dá),但表達(dá)量有差別,其中根的表達(dá)較低,卷須中表達(dá)相對較高;VaCIPK02受4℃低溫誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá),在6h時表達(dá)量達(dá)到較高。受ABA誘導(dǎo)呈下調(diào)表達(dá)。VaCIPK02蛋白定位于細(xì)胞核、葉綠體及細(xì)胞膜。VaCIPK02及VaCIPK02△NAF無自激活活性,但VaCIPK02△S_TKc具有自激活活性。VaCIPK02與山葡萄的4個CBLs互作(VaCBL01、VaCBL04、VaCBL05與VaCBL08);VaCIPK02自身不能形成同源二聚體。篩選山葡萄經(jīng)-2℃低溫誘導(dǎo)的酵母cDNA文庫,篩選出20個互作蛋白,通過隨機回復(fù)雜交驗證表明VaCIPK02蛋白與VaPYL9互作。3、山葡萄VaCIPK02基因及其啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的功能分析。同源克隆了VaCIPK02基因上游2269bp的啟動子序列,構(gòu)建了 ProaVaCIPK02::GUS融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因純合體。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明,VaCIPK02啟動子受逆境脅迫(NaCl、甘露醇、4℃低溫)與激素(ABA)誘導(dǎo)表達(dá)強度有差異。通過構(gòu)建35S::VaCIPK02::EGFP植物表達(dá)載體,進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得VaCIPK02過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥材料,在ABA脅迫條件下,與WT相比,VaCIPK02過表達(dá)植株對ABA表現(xiàn)出超敏感性。
【圖文】：

芥中ＡｔＣＢＬＯｌ以及毛果楊中ＰｔＣＢＬＯ丨蛋白相似度較大，分別達(dá)到９５．３％、９５．３％和９４．８％，與逡逑ＴａＣＢＬ０３蛋白相似性最低，為７７．３％。利用ＭＥＧＡ邋７．０軟件中的最大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ邋ｌｉｋｅｈｏｏｄ），逡逑將山葡萄的ＶａＣＢＬＯ】序列與９個其他物種的ＣＢＬ蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖２－２）。經(jīng)聚類分析逡逑后，，發(fā)現(xiàn)可聚類為２個分支，第一分支包括玉米ＺｍＣＢＬ０９、小麥ＴａＣＢＬＯｌ、水稻ＯｓＣＢＬＯｌ、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０４、大豆ＧｍＣＢＬＯｌ與木薯ＭｅＣＢＬ；第二分支包括毛果楊ＰｔＣＢＬＯｌ、擬南芥ＡｔＣＢＬＯ】、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０１與歐洲葡萄ＶｖＣＢＬＯｌ。其中，ＶａＣＢＬＯｌ與歐洲葡萄ＶｖＣＢＬＯ丨親緣關(guān)系最近。逡逑９￣｜邐Ｚｅａ邋ｍａｙｓ邋ＺｍＣＢＬ０９邋ＮＰ邋００１１５邋Ｊ邋３１９．］逡逑邐Ｅ邋邐玉米邋Ｍ邋ＺｍＣＢＬＯ邋ｉ邋ＯＮＬ９９９０７．１逡逑■■邐邐小麥邋７＞ｖ／／ｃｒ＂ｍ邋ｔｆｉｓ／ｍｗｎ邋ＴａＣＢＬＵｌ邋ＡＦＲ９０２０８．１逡逑邐邐水稻（９＾２０邋似／ｉｗ邋ＯｓＣＢＵ）邋１邋ＸＰ邋０邋丨丨邋４２６Ｘ邋Ｊ邐ｆ逡逑４２邐．…．＂＂＂番菊邐ＳＩＣＢＬＭ邋ＸＰ邋｛）（Ｗ２４（Ｗ５７．１逡逑邐小麥邋Ｚｈ／ｉｎ／ｍ邐ＴａＣＢＬ０３邐ＡＦＲ９０２１０．１逡逑＾邐大豆邐ｗａｖ邋ＧｍＣＢＬＵｌ邋ＸＰ邋００３５３８７５９」逡逑１邐＿邋￣邐＼ｆａｎｉｈｏｉｔ＾ｃｕｉｔｍｔａ邋ＭｃＣＢＬ邐■■逡逑邐毛果楊尸0／講／奶邐ＰｔＣＢＬＯｌ邋ＸＰ邋ＯＵ６３８５３７４．１邐邐逡逑邐邐邋邐擬南芥逡逑，，邋廠邐邋番獲：辦

均不能正常生長。在ＳＤＯ／Ａ／Ｘ培養(yǎng)基上陽性對照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋ｐ５３／ＢＤ）正常生長并且變藍(lán)，而雙陰逡逑性對照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋Ｌａｍ／ＢＤ和ＢＤ空載體）及１９個ＶａＣＩＰＫｓ／ｐＧＢＫＴ７單克隆菌株均不能正常生長逡逑（圖２－５），證明１９個ＶａＣＩＰＫｓ均無自激活活性，為探宄山葡萄ＶａＣＢＬＯｌ與１９個ＶａＣＩＰＫｓ蛋白逡逑的互作提供理論依據(jù)。逡逑邐ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ邐邋ＮＥ逡逑．旁，公、在邋名；＿逡逑＾邋＾邐＾邋＾邋＾邋＾邐＾邋ｓｋ邋＾逡逑ＳＤ／－Ｔｒｐ逡逑■邋ＳＤ／－ＴｒｐＭｂＡ，Ｘ－ａ－ｇａｌ逡逑邐ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ邐Ｅｍｐｔｙ邋ＰＯ逡逑．／邋／邋／邋／邋／邋／逡逑Ｊ邋ＳＤ／－Ｔｒｐ／ＡｂＡ／Ｘ－ａ－ｇａＩ逡逑圖２－５山葡萄ＶａＣＩＰＫｓ自激活活性分析逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｏｆ邋ＶａＣＩＰＫｓ逡逑－１６－逡逑
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S663.1

【相似文獻(xiàn)】

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1 申威;山葡萄CBL-CIPKs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中兩個關(guān)鍵基因響應(yīng)逆境脅迫的功能分析[D];寧夏大學(xué);2019年

本文編號：2607019