在魚類和其它脊椎動物中，胰島素樣生長因子（IGF）信號系統(tǒng)對于機體的生長、代謝和繁殖有著非常重要的作用。該信號系統(tǒng)由兩個配體（IGF-I，IGF-II）、兩個受體（IGF-IR、IGF-IIR）和六個IGF結合蛋白（IGFBP1-6）組成。其中，IGFBPs不僅有依賴IGFs的作用，如調控IGFs的生物利用率、刺激或抑制IGFs的生物活性，還有不依賴IGFs的獨立作用，可以通過結合細胞表面受體或直接進入細胞核調控細胞的生長和分化。在本研究中，我們首先從健康牙鲆肝臟組織中克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因序列并進行分析；利用熒光定量PCR技術分析了牙鲆四種IGFBPs基因的在成體組織中的分布和在不同發(fā)育時期的胚胎和仔魚中的表達差異；利用原代培養(yǎng)的牙鲆肝臟組織細胞研究了不同激素對牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因的表達調控作用；最后克隆得到牙鲆四種IGFBPs基因的啟動子序列并進行了生物信息學分析。本研究的主要結果如下： （1）本研究克隆得到了牙鲆兩個IGFBP-2基因。其中IGFBP-2a基因cDNA長1186bp，由42bp長的5’UTR、861bp長的ORF...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 胰島素樣生長化因子信號系統(tǒng)
        1.1 IGF 配體
        1.2 IGF 受體
        1.3 IGF 結合蛋白
        1.4 IGFs 信號系統(tǒng)對生長發(fā)育的作用
    2 胰島素樣生長因子結合蛋白
        2.1 六種 IGFBPs
        2.2 IGFBPs 的結構
        2.3 IGFBPs 對 IGFs 的調控作用
        2.4 IGFBPs 不依賴 IGFs 的作用
    3 IGFBP 在魚類中的研究
        3.1 魚類 IGFBPs 的發(fā)現
        3.2 魚類 IGFBPs 的克隆
        3.3 魚類 IGFBP 的表達和調控
    4 本實驗的目的和意義
第二章 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的克隆和表達分析
    1 材料和方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗動物
            1.1.2 不同成體組織的取材
            1.1.3 不同發(fā)育時期樣品的取材
        1.2 實驗所用引物
        1.3 總 RNA 的提取及純化
            1.3.1 總 RNA 的提取
            1.3.2 總 RNA 的純化
        1.4 牙鲆 cDNA 第一條鏈的合成
        1.5 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心片段的獲得
            1.5.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心片段的克隆
            1.5.2 連接反應
            1.5.3 轉化與篩選
        1.6 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因全長 cDNA 序列的獲得
            1.6.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 3’UTR 的獲得
            1.6.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 5’UTR 的獲得
            1.6.3 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 cDNA 序列的獲得
        1.7 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因序列分析
        1.8 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的組織分布和時序表達分析
            1.8.1 模板 cDNA 的合成
            1.8.2 實時熒光定量 PCR
            1.8.3 數據處理
    2 結果
        2.1 牙鲆總 RNA 的提取
        2.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因核心序列的克隆
        2.3 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因 cDNA 序列的獲得和分析
        2.4 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的蛋白結構和聚類分析
            2.4.1 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的蛋白結構預測和分析
            2.4.2 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的系統(tǒng)進化分析
        2.5 牙鲆 IGFBP-2a 和-2b 基因的組織分布和時序表達
            2.5.1 牙鲆 IGFBP-2a 基因的組織分布和時序表達分析
            2.5.2 牙鲆 IGFBP-2b 基因的組織分布和時序表達分析
    討論
第三章 牙鲆 IGFBP-3 基因的克隆和表達分析
    1 材料和方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗所用引物
        1.3 總 RNA 的提取及純化
        1.4 牙鲆 cDNA 第一條鏈的合成
        1.5 牙鲆 IGFBP-3 基因核心片段的獲得
        1.6 牙鲆 IGFBP-3 基因全長 cDNA 序列的獲得
        1.7 牙鲆 IGFBP-3 基因組序列的獲得
            1.7.1 牙鲆基因組 DNA 的提取
            1.7.2 牙鲆 IGFBP-3 基因全長序列的獲得
        1.8 牙鲆 IGFBP-3 基因序列分析
        1.9 牙鲆 IGFBP-3 基因的組織分布和時序表達分析
    2 結果
        2.1 牙鲆 IGFBP-3 基因 cDNA 序列的克隆和分析
        2.2 牙鲆 IGFBP-3 基因序列克隆和分析
        2.3 牙鲆 IGFBP-3 基因的蛋白結構和聚類分析
            2.3.1 牙鲆 IGFBP-3 基因的蛋白結構預測和分析
            2.3.2 牙鲆 IGFBP-3 基因的系統(tǒng)進化分析
        2.4 牙鲆 IGFBP-3 基因的組織分布和時序表達
            2.4.1 牙鲆 IGFBP-3 基因在成體組織中的表達
            2.4.2 牙鲆 IGFBP-3 基因在不同發(fā)育時期的胚胎和仔魚中的表達
    討論
第四章 牙鲆 IGFBP-4 基因的克隆、表達分析和原核表達
    第一節(jié) 牙鲆 IGFBP-4 基因的克隆和表達分析
        1 材料和方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗所用引物
            1.3 總 RNA 的提取及純化
            1.4 牙鲆 cDNA 第一條鏈的合成
            1.5 牙鲆 IGFBP-4 基因核心片段的獲得
            1.6 牙鲆 IGFBP-4 基因全長 cDNA 序列的獲得
            1.7 牙鲆 IGFBP-4 基因組序列的獲得
            1.8 牙鲆 IGFBP-4 基因序列分析
            1.9 牙鲆 IGFBP-4 基因的組織分布和時序表達分析
        2 結果
            2.1 牙鲆 IGFBP-4 基因 cDNA 序列的克隆和分析
            2.2 牙鲆 IGFBP-4 基因序列克隆和分析
            2.3 牙鲆 IGFBP-4 基因的蛋白結構和聚類分析
                2.3.1 牙鲆 IGFBP-4 基因的蛋白結構預測和分析
                2.3.2 牙鲆 IGFBP-4 基因的系統(tǒng)進化分析
            2.4 牙鲆 IGFBP-4 基因的組織分布和時序表達
                2.4.1 牙鲆 IGFBP-4 基因在成體組織中的表達
                2.4.2 牙鲆 IGFBP-4 基因在不同發(fā)育時期的胚胎和仔魚中的表達
    第二節(jié) 牙鲆 IGFBP-4 的原核表達及產物純化
        1 材料和方法
            1.1 實驗材料和試劑
            1.2 目的片段的擴增
            1.3 重組質粒的構建
                1.3.1 質粒提取
                1.3.3 重組質粒的構建
            1.4 重組菌株誘導條件的優(yōu)化
                1.4.1 重組菌株的活化和表達誘導
                1.4.2 SDS-PAGE
                1.4.3 誘導時間和溫度優(yōu)化
            1.5 重組蛋白的可溶性分析和純化
        2 結果
            2.1 牙鲆 IGFBP-4 成熟肽片段的獲得
            2.2 重組質粒的構建
            2.3 重組蛋白誘導時間和溫度優(yōu)化
                2.3.1 重組蛋白誘導時間的優(yōu)化
                2.3.2 重組蛋白培養(yǎng)溫度的優(yōu)化
            2.4 重組蛋白的可溶性分析和純化
    討論
第五章 激素對牙鲆 IGFBP-3 和-4 基因的體外表達調控
    1 材料和方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗動物
            1.1.2 實驗試劑
            1.1.3 溶液配制
        1.2 牙鲆肝細胞的分離
        1.3 臺盼藍染色和細胞計數
            1.3.1 臺盼藍染色
            1.3.2 肝細胞計數
        1.4 牙鲆肝細胞原代培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
        1.5 不同激素對牙鲆肝細胞的刺激
            1.5.1 GH 對牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的劑量和時間效應
            1.5.2 胰島素對牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的劑量和時間效應
            1.5.3 IGF-I 對牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的劑量和時間效應
            1.5.4 IGF-II 對牙鲆 IGFBP-3 和 IGFBP-4 的劑量和時間效應
        1.6 不同激素對 IGFBP-3 和 IGFBP-4 在牙鲆肝細胞中的表達分析
    2 結果
        2.1 牙鲆肝臟組織細胞的分離
        2.2 原代培養(yǎng)細胞總 RNA 的提取
        2.3 激素對牙鲆肝細胞 IGFBP-3 的表達調控
            2.3.1 GH 對牙鲆肝細胞 IGFBP-3 的表達調控
            2.3.2 胰島素對牙鲆肝細胞 IGFBP-3 的表達調控
            2.3.3 IGF-I 對牙鲆肝細胞 IGFBP-3 的表達調控
            2.3.4 IGF-II 對牙鲆肝細胞 IGFBP-3 的表達調控
        2.4 激素對牙鲆肝細胞 IGFBP-4 的表達調控
            2.4.1 GH 對牙鲆肝細胞 IGFBP-4 的表達調控
            2.4.2 胰島素對牙鲆肝細胞 IGFBP-4 的表達調控
            2.4.3 IGF-I 對牙鲆肝細胞 IGFBP-4 的表達調控
            2.4.4 IGF-II 對牙鲆肝細胞 IGFBP-4 的表達調控
    討論
第六章 牙鲆 IGFBPs 基因啟動子的克隆及序列分析
    1 材料和方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗動物
            1.1.2 實驗試劑
        1.2 實驗所用引物
        1.3 牙鲆基因組 DNA 的提取
        1.4 染色體步移
        1.5 牙鲆四種 IGFBP 基因啟動子序列的獲得
            1.5.1 引物設計
            1.5.2 牙鲆 IGFBP-4 基因啟動子序列的克隆
        1.6 牙鲆四種 IGFBP 基因啟動子序列的生物信息學分析
    2. 結果
        2.1 牙鲆四種 IGFBP 基因啟動子序列的獲得
        2.2 牙鲆四種 IGFBP 基因啟動子序列的生物信息學分析
    討論
參考文獻
個人簡歷
發(fā)表的學術論文
致謝



本文編號：4043387