胸腺素β4作為新近發(fā)現(xiàn)的能同時(shí)具有抑制細(xì)菌生長和促進(jìn)傷口愈合兩種功能的重要基因,在斑節(jié)對(duì)蝦中未展開研究。本研究克隆了斑節(jié)對(duì)蝦胸腺素β4(Pmβ4)基因,并對(duì)其在抗菌免疫和傷口愈合中的作用進(jìn)行了探究。通過液體培養(yǎng)基法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)研究了Pmβ4在體外的抑菌活性。借助RNAi和過表達(dá)等技術(shù)明確了Pmβ4對(duì)血淋巴中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)的清除作用以及Pmβ4對(duì)對(duì)蝦存活率的影響。通過RNAi和過表達(dá)等技術(shù)探究了Pmβ4和傷口愈合關(guān)鍵基因(過氧化氫基因catalase和超氧化物歧化酶基因superoxide dismutase)的關(guān)聯(lián)關(guān)系。通過制備組織切片進(jìn)一步明確了Pmβ4對(duì)于傷口愈合的影響。初步揭示了斑節(jié)對(duì)蝦Pmβ4在先天免疫和傷口愈合中的作用機(jī)制,為對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病原感染和防治,及創(chuàng)傷修復(fù)等問題的解決提供理論支持。(1)在轉(zhuǎn)錄組中獲得Pmβ4 c DNA序列全長。開放閱讀框有501 bp,編碼166個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子量18714.05 D,等電點(diǎn)5.75。多重序列比對(duì)和進(jìn)化樹結(jié)果顯示,斑節(jié)對(duì)蝦Pmβ4與其他對(duì)蝦胸腺素β4相似性較高且聚為...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 文獻(xiàn)綜述
        1.1.1 斑節(jié)對(duì)蝦的簡介
        1.1.2 胸腺素β4的功能及研究現(xiàn)狀
            1.1.2.1 炎癥反應(yīng)
            1.1.2.2 傷口愈合
            1.1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞再生及血管生成
            1.1.2.4 腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移
    1.2 本研究的目的和意義
第二章 斑節(jié)對(duì)蝦胸腺素β4基因的克隆和序列分析
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)器材
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備
        2.3.2 總RNA提取
        2.3.3 cDNA第一鏈的合成
        2.3.4 Pmβ4 全長cDNA克隆
            2.3.4.1 Pmβ4基因的引物設(shè)計(jì)
            2.3.4.2 驗(yàn)證Pmβ4基因的開放閱讀框
            2.3.4.3 膠回收PCR目標(biāo)產(chǎn)物
            2.3.4.4 連接與轉(zhuǎn)化
            2.3.4.5 挑取單克隆與菌液PCR
            2.3.4.6 RACE克隆Pmβ4 3’非編碼區(qū)
        2.3.5 Pmβ4的生物信息學(xué)分析與進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.3.6 Pmβ4的定量表達(dá)分析
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 Pmβ4序列與生物信息學(xué)分析
        2.4.2 Pmβ4的多重序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析
        2.4.3 Pmβ4的組織表達(dá)模式
    2.5 討論
第三章 斑節(jié)對(duì)蝦胸腺素β4的抗菌作用分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)器材
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 RNA干擾實(shí)驗(yàn)
            3.3.1.1 重組載體pD7-β4和pD7-GFP的構(gòu)建
            3.3.1.2 體外轉(zhuǎn)錄模板的制備
            3.3.1.3 雙鏈RNA的體外轉(zhuǎn)錄
            3.3.1.4 雙鏈RNA的純化
        3.3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.2.1 pET-32a-Pmβ4 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
            3.3.2.2 蛋白SDS-PAGE電泳分析
            3.3.2.3 蛋白免疫印跡Western Blotting
            3.3.2.4 Pmβ4重組蛋白破碎、純化及透析
            3.3.2.5 Pmβ4重組蛋白濃度測(cè)定
        3.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)Pmβ4 與細(xì)菌間的結(jié)合能力
        3.3.4 液體培養(yǎng)基法檢測(cè)重組蛋白Pmβ4的體外抗菌能力
        3.3.5 菌刺激下基因Pmβ4的定量表達(dá)分析
        3.3.6 副溶血弧菌應(yīng)激試驗(yàn)
            3.3.6.1 原位雜交實(shí)驗(yàn)
            3.3.6.2 血淋巴對(duì)副溶血弧菌的清除實(shí)驗(yàn)
            3.3.6.3 存活率統(tǒng)計(jì)分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 Pmβ4重組蛋白的原核表達(dá)
            3.4.1.1 Pmβ4最優(yōu)原核表達(dá)條件
            3.4.1.2 Pmβ4的純化與蛋白印跡
        3.4.2 重組蛋白Pmβ4與細(xì)菌間的結(jié)合能力
        3.4.3 重組蛋白Pmβ4在液體培養(yǎng)基法中的體外抗菌能力
        3.4.4 菌刺激后Pmβ4相對(duì)表達(dá)量的變化
        3.4.5 副溶血弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)
            3.4.5.1 熒光定量判斷干擾效果
            3.4.5.2 原位雜交
            3.4.5.3 Pmβ4對(duì)血淋巴中副溶血弧菌的清除實(shí)驗(yàn)
            3.4.5.4 存活率統(tǒng)計(jì)
    3.5 討論
第四章 斑節(jié)對(duì)蝦胸腺素β4促進(jìn)傷口愈合的作用分析
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)器材
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 實(shí)驗(yàn)用品預(yù)處理
        4.3.2 總RNA提取
        4.3.3 cDNA的合成
        4.3.4 制造傷口后基因Pmβ4的定量表達(dá)分析
        4.3.5 傷口愈合基因的表達(dá)測(cè)定
            4.3.5.1 定量引物設(shè)計(jì)
            4.3.5.2 基因定量分析
        4.3.6 組織切片
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 制造傷口后Pmβ4的表達(dá)情況
        4.4.2 制造傷口后過氧化氫基因CAT的表達(dá)情況
        4.4.3 制造傷口后超氧化物歧化酶基因SOD的表達(dá)情況
        4.4.4 組織切片
    4.5 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3992510