原始生殖細(xì)胞(PGCs)是生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞，在胚胎發(fā)育的早期形成后遷移到性腺原基，成為性原細(xì)胞，并最終發(fā)育成兩性配子。近年來，由于對性別分化機(jī)制研究的不斷深入，生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育和分化日益成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。魚類生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的研究將為深入開展魚類生殖細(xì)胞發(fā)生發(fā)育、遷移和性別分化研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時對魚類種質(zhì)資源保存和繁殖育種都具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。然而目前海水養(yǎng)殖魚類生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的相關(guān)研究較少。半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。而半滑舌鰨雌魚比雄魚生長快且個體大，在養(yǎng)殖條件下生理雌魚比例低、不能自然產(chǎn)卵且產(chǎn)卵量有限，限制了舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。全雌苗種的培育和代理繁殖技術(shù)可以解決上述問題，但是對半滑舌鰨性別分化機(jī)制缺乏深入了解和生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的研究非常有限，成為制約相關(guān)研究開展的重要因素。 本研究通過RACE和PCR結(jié)合的方法克隆了半滑舌鰨生殖細(xì)胞標(biāo)記基因vasa、nanos、dnd和pou2全長cDNA和DNA序列，分析這些基因的序列特征。通過熒光定量PCR分析這些基因在胚胎發(fā)育過程、成魚各組織以及偽雄魚性腺的表...

【文章頁數(shù)】：170 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 魚類原始生殖細(xì)胞研究進(jìn)展
        1.1.1 魚類PGCs的特征和鑒定方法
        1.1.2 魚類PGCs的起源
        1.1.3 魚類PGCs的遷移
        1.1.4 魚類PGCs發(fā)生發(fā)育的相關(guān)基因
        1.1.5 魚類PGCs的可視化標(biāo)記及應(yīng)用
    1.2 vasa基因研究進(jìn)展
        1.2.1 vasa基因的結(jié)構(gòu)和序列特征
        1.2.2 vasa基因在魚類發(fā)育過程中的表達(dá)
        1.2.3 vasa基因的功能和應(yīng)用
    1.3 nanos基因研究進(jìn)展
        1.3.1 nanos基因的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 nanos基因的表達(dá)和功能
    1.4 dnd基因研究進(jìn)展
    1.5 pou2 基因研究進(jìn)展
    1.6 本研究的意義及目的
第二章 半滑舌鰨vasa基因克隆、表達(dá)分析及調(diào)控區(qū)功能驗(yàn)證
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 主要試劑和儀器
        2.2.3 高溫誘導(dǎo)偽雄魚
        2.2.4 基因組DNA和總RNA提取及cDNA的合成
            2.2.4.1 基因組DNA的提取
            2.2.4.2 總RNA的提�。═rizol法）
            2.2.4.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成
        2.2.5 半滑舌鰨遺傳和生理性別鑒定
        2.2.6 半滑舌鰨vasa基因克隆
            2.2.6.1 vasa基因部分片段的獲得
            2.2.6.2 vasa基因全長cDNA和DNA序列的獲得
        2.2.7 半滑舌鰨vasa轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        2.2.8 載體構(gòu)建及顯微注射
            2.2.8.1 GFP-Csvasa 3'UTR mRNA構(gòu)建及顯微注射
            2.2.8.2 pCsvasa-GFP-T轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建及顯微注射
        2.2.9 轉(zhuǎn)基因青鳉檢測
        2.2.10 vasa基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.2.11 熒光定量PCR
        2.2.12 原位雜交研究vasa mRNA在性腺中的定位
            2.2.12.1 vasa RNA探針合成
            2.2.12.2 性腺切片原位雜交
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 半滑舌鰨vasa基因克隆及序列分析
        2.3.2 半滑舌鰨vasa基因調(diào)控序列克隆及生物信息學(xué)分析
        2.3.3 pCsvasa-GFP-T表達(dá)載體構(gòu)建
        2.3.4 pCsvasa-GFP-T在青鳉胚胎中的表達(dá)及檢測
        2.3.5 pCsvasa-GFP-T在轉(zhuǎn)基因青鳉原代的整合率檢測
        2.3.6 GFP-Csvasa 3'UTR mRNA瞬時標(biāo)記青鳉PGCs
        2.3.7 半滑舌鰨vasa基因成魚不同組織表達(dá)特征
        2.3.8 vasa基因在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)特征
        2.3.9 vasa基因在性腺分化過程中表達(dá)特征
    2.4 討論
        2.4.1 半滑舌鰨vasa基因的克隆和序列特征分析
        2.4.2 半滑舌鰨vasa基因的表達(dá)分析
        2.4.3 半滑舌鰨vasa調(diào)控序列克隆及分析
        2.4.4 半滑舌鰨vasa 3'UTR瞬時標(biāo)記PGCs
第三章 半滑舌鰨nanos基因克隆、表達(dá)分析及調(diào)控區(qū)功能驗(yàn)證
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和取樣
        3.2.2 主要試劑和儀器
        3.2.3 高溫誘導(dǎo)偽雄魚
        3.2.4 基因組DNA和總RNA提取及cDNA的合成
        3.2.5 半滑舌鰨遺傳和生理性別鑒定
        3.2.6 半滑舌鰨nanos基因克隆
            3.2.6.1 nanos基因部分片段的獲得
            3.2.6.2 nanos基因全長cDNA和DNA序列的獲得
        3.2.7 半滑舌鰨nanos轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        3.2.8 GFP-Csnanos 3'UTR mRNA構(gòu)建及顯微注射
        3.2.9 nanos基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建
        3.2.10 熒光定量PCR
        3.2.11 原位雜交研究nanos mRNA在性腺中的定位
            3.2.11.1 nanos RNA探針合成
            3.2.11.2 性腺切片原位雜交
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 半滑舌鰨nanos基因全長cDNA和DNA序列的克隆
        3.3.2 半滑舌鰨nanos調(diào)控序列克隆與分析
        3.3.3 半滑舌鰨nanos基因的生物信息學(xué)分析
        3.3.4 半滑舌鰨nanos基因在胚胎發(fā)育期的表達(dá)特征
        3.3.5 半滑舌鰨nanos基因在成魚各組織的表達(dá)特征
        3.3.6 半滑舌鰨nanos基因在性腺分化過程中的表達(dá)特征
        3.3.7 半滑舌鰨nanos基因在雄魚、偽雄魚和雌魚性腺中的表達(dá)特征 ..86
        3.3.8 GFP-Csnanos 3'UTR mRNA瞬時標(biāo)記青鳉PGCs
    3.4 討論
        3.4.1 半滑舌鰨nanos基因的克隆和序列特征分析
        3.4.2 半滑舌鰨nanos基因的表達(dá)分析
        3.4.3 半滑舌鰨nanos調(diào)控序列克隆及分析
第四章 半滑舌鰨dnd基因克隆與表達(dá)分析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和取樣
        4.2.2 主要試劑和儀器
        4.2.3 高溫誘導(dǎo)偽雄魚
        4.2.4 基因組DNA和總RNA提取及cDNA的合成
        4.2.5 半滑舌鰨遺傳和生理性別鑒定
        4.2.6 半滑舌鰨dnd基因克隆
            4.2.6.1 dnd基因部分片段的獲得
            4.2.6.2 dnd基因全長cDNA和DNA序列的獲得
        4.2.7 半滑舌鰨dnd轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        4.2.8 GFP-Csdnd 3'UTR mRNA構(gòu)建
        4.2.9 dnd基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建
        4.2.10 熒光定量PCR
        4.2.11 原位雜交研究dnd mRNA在性腺中的定位
            4.2.11.1 dnd RNA探針合成
            4.2.11.2 性腺切片原位雜交
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 半滑舌鰨dnd基因克隆及序列分析
        4.3.2 半滑舌鰨dnd轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        4.3.3 半滑舌鰨dnd基因序列生物信息學(xué)分析
        4.3.4 半滑舌鰨dnd基因在胚胎發(fā)育期的表達(dá)特征
        4.3.5 半滑舌鰨dnd基因在成魚各組織的表達(dá)特征
        4.3.6 半滑舌鰨dnd基因在性腺分化過程中的表達(dá)特征
        4.3.7 半滑舌鰨dnd基因在雄魚、偽雄魚和雌魚性腺中的表達(dá)特征
    4.4 討論
        4.4.1 半滑舌鰨dnd基因的克隆和序列特征分析
        4.4.2 半滑舌鰨dnd基因的表達(dá)分析
        4.4.3 半滑舌鰨dnd調(diào)控序列克隆及分析
第五章 半滑舌鰨pou2 基因克隆與表達(dá)分析
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和取樣
        5.2.2 主要試劑和儀器
        5.2.3 高溫誘導(dǎo)偽雄魚
        5.2.4 基因組DNA和總RNA提取及cDNA的合成
        5.2.5 半滑舌鰨遺傳和生理性別鑒定
        5.2.6 半滑舌鰨pou2 基因克隆
            5.2.6.1 pou2 基因部分片段的獲得
            5.2.6.2 pou2 基因全長cDNA和DNA序列的獲得
        5.2.7 半滑舌鰨pou2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        5.2.8 GFP-Cspou 3'UTR mRNA構(gòu)建
        5.2.9 pou2 基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建
        5.2.10 熒光定量PCR
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 半滑舌鰨pou2 基因克隆及序列分析
        5.3.2 半滑舌鰨pou2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列克隆及分析
        5.3.3 半滑舌鰨pou2 基因的生物信息學(xué)分析
        5.3.4 半滑舌鰨pou2 基因在胚胎發(fā)育期的表達(dá)特征
        5.3.5 半滑舌鰨pou2 基因在成魚各組織的表達(dá)特征
        5.3.6 半滑舌鰨pou2 基因在性腺分化過程中的表達(dá)特征
        5.3.7 半滑舌鰨pou2 基因在雄魚、偽雄魚和雌魚性腺中的表達(dá)特征.129
    5.4 討論
        5.4.1 半滑舌鰨pou2 基因的克隆和序列特征分析
        5.4.2 半滑舌鰨pou2 基因的表達(dá)分析
        5.4.3 半滑舌鰨pou2 調(diào)控序列克隆及分析
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3971982