以溶藻弧菌HY9901為模板，參照GenBank上登錄的其他溶藻弧菌菌株二氫硫辛酰胺脫氫酶基因及D-酪氨酸-tRNA脫�；富蛐蛄性O計引物，克隆了溶藻弧菌HY9901菌株的dldh和dtd基因，并對其進行生物信息學分析。結果表明dldh基因含有一個1428bp的開放閱讀框，編碼475個氨基酸，預測其相對分子量為50.99kDa，理論等電點為5.51，Blast分析發(fā)現溶藻弧菌DLDH與副溶血弧菌同源性高達99%，與哈維氏弧菌高達96%。而dtd基因全長435bp，編碼144個氨基酸序列，理論分子量為16.09，理論等電點為4.98，Blast分析發(fā)現溶藻弧菌DTD與副溶血弧菌同源性高達95%，與哈維氏弧菌高達96%。 將擴增到的dldh與dtd分別亞克隆到pET-32a(+)質粒中，構建pET-DLDH，pET-DTD原核表達質粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。蛋白表達條件優(yōu)化分析，DLDH在37℃，IPTG濃度0.7mmol/L時誘導4h蛋白表達量最大，重組蛋白主要以包涵體形式存在；DTD在37℃，0.1mmol/L的IPTG濃度下誘導5h時重組蛋白以包涵體形式大量表達。蛋...

【文章頁數】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
1 文獻綜述
    1.1 三種弧菌研究簡介
        1.1.1 溶藻弧菌
        1.1.2 哈維氏弧菌
        1.1.3 副溶血弧菌
    1.2 疫苗的研究進展
        1.2.1 傳統(tǒng)疫苗
        1.2.2 基因工程疫苗
    1.3 DLDH 及 DTD 的研究進展
        1.3.1 二氫硫辛酰胺脫氫酶
        1.3.2 D-酪氨酰-tRNA 脫酰基酶
    1.4 本研究技術路線
    1.5 研究目的及意義
2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆與原核表達
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 質粒載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.6 生物信息學分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.2.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表達
    2.3 實驗結果與分析
        2.3.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.3.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表達
    2.4 討論
3 DLDH-DTD 融合表達載體的構建與表達
    3.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 dldh 及 dtd 基因的擴增
        3.2.2 重疊延伸拼接技術擴增融合基因
        3.2.3 原核表達載體構建及表達純化
    3.3 結果與分析
        3.3.1 融合基因的擴增及菌落 PCR 鑒定
        3.3.2 原核表達載體構建及表達純化
    3.4 討論
4 DLDH、DTD 及 DLDH-DTD 融合基因表達產物對斜帶石斑魚的免疫效果
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株及質粒
        4.1.2 實驗魚體
        4.1.3 實驗儀器及試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 亞單位疫苗制作
        4.2.2 安全性評價
        4.2.3 對斜帶石斑魚的免疫保護
        4.2.4 抗體效價檢測（間接 ELISA）
    4.3 結果與分析
        4.3.1 安全性評估
        4.3.2 免疫保護率
        4.3.3 血清效價分析
    4.4 討論
5 DLDH 突變株的構建及功能研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株與質粒
        5.1.2 實驗儀器
        5.1.3 主要試劑與溶液
    5.2 實驗方法
        5.2.1 插入法構建突變株
        5.2.2 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢驗
        5.2.3 突變株與野生株生長曲線的比較
        5.2.4 細菌泳動檢測
        5.2.5 酶活測定
        5.2.6 生物膜檢測
    5.3 結果與分析
        5.3.1 構建插入突變株及遺傳穩(wěn)定性檢測
        5.3.2 插入突變株遺傳穩(wěn)定性檢測
        5.3.3 生長曲線的測定
        5.3.4 細菌泳動實驗
        5.3.5 酶活測定
        5.3.6 生物膜檢測
    5.4 結論
6 結論
參考文獻
致謝
作者簡介
導師簡介



本文編號：3810779