腫瘤壞死因子（TNF）是一種重要的細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)脊椎動物器官發(fā)育、組織修復(fù)、造血作用以及炎癥反應(yīng)等多個生理過程，并在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，目前無脊椎動物腫瘤壞死因子相關(guān)研究剛剛起步。本研究選取長牡蠣為研究對象，利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物信息學(xué)的相關(guān)手段，從長牡蠣基因組中篩選獲得一個具有典型TNF結(jié)構(gòu)域的分子（命名為CgTNF-1），對其進(jìn)行了克隆、原核重組表達(dá)以及相關(guān)功能的研究。 CgTNF-1分子的ORF全長1014bp，編碼337個氨基酸的多肽；預(yù)測的蛋白分子量為38.01kDa，等電點（PI）為8.25。其氨基端端具有一個特征性的跨膜結(jié)構(gòu)域，羧基端為典型的TNF結(jié)構(gòu)域，兩者通過一段不明確的結(jié)構(gòu)域相連。研究發(fā)現(xiàn)CgTNF-1與薩氏海鞘Ciona savignyi中的TNF分子有較高同源性，在進(jìn)化樹分析中被聚類為一支，而與脊椎動物及果蠅腫瘤壞死因子的相似性較低。CgTNF-1mRNA在鰓、性腺、血淋巴、肝胰腺等所有被檢測的組織中呈組成型分布，在鰓、心臟、血淋巴和肝胰腺中表達(dá)量較高。而CgTNF-1蛋白以可溶型形式定位在牡蠣血淋巴細(xì)胞核周圍。 發(fā)現(xiàn)牡蠣血淋巴細(xì)胞中CgT...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
第一章 研究背景
    第一節(jié) 細(xì)胞因子簡介
    第二節(jié) 脊椎動物腫瘤壞死因子的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究
        一、 腫瘤壞死因子超家族的發(fā)現(xiàn)史及研究進(jìn)展
        二、 腫瘤壞死因子超家族的結(jié)構(gòu)及分類
        三、 腫瘤壞死因子超家族的功能及其與生命活動的密切關(guān)系
        四、 腫瘤壞死因子超家族的作用機(jī)制
    第三節(jié) 無脊椎動物腫瘤壞死因子的研究進(jìn)展
    第四節(jié) 本研究的主要目的及意義
        一、 研究意義
        二、 研究內(nèi)容
第二章 實驗材料與方法
    第一節(jié) 實驗材料
        一、 實驗用動物及相關(guān)菌株
        二、 實驗用細(xì)胞株
        三、 實驗用試劑及主要儀器
        四、 實驗用引物的主要信息
    第二節(jié) 實驗方法
        一、 長牡蠣總 RNA 的提取
        二、 cDNA 文庫的構(gòu)建
        三、 目的基因的克隆及測序
        四、 基于雙酶切技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒
        五、 基于 His 標(biāo)簽的重組蛋白的可溶性原核表達(dá)及純化
        六、 多克隆抗體的制備及鑒定
        七、 western blotting 分析
        八、 實時熒光定量 PCR
        九、 長牡蠣血淋巴細(xì)胞的原代培養(yǎng)
        十、 免疫熒光組化
        十一、LPS 刺激及牡蠣組織材料的收集
        十二、CgTNF-1 免疫劑量確定實驗
        十三、LPS 和 CgTNF-1 共刺激實驗及血細(xì)胞和血淋巴上清的收集
        十四、血淋巴細(xì)胞凋亡作用的檢測
        十五、血淋巴細(xì)胞吞噬作用的檢測
        十六、血淋巴上清 NO 含量及免疫相關(guān)酶的檢測
        十七、血淋巴上清抗菌能力的檢測
        十八、ELISA 檢測 PAMPs 結(jié)合實驗
        十九、細(xì)胞增殖與毒性檢測實驗
        二十、實驗數(shù)據(jù)處理
第三章 實驗結(jié)果
    第一節(jié) CgTNF-1 分子的基本特征
        一、 CgTNF-1 分子的篩選及基本特征
        二、 CgTNF-1 蛋白同源性和進(jìn)化分析
    第二節(jié) CgTNF-1 的原核可溶性表達(dá)和抗體制備
    第三節(jié) CgTNF-1 的組織分布和細(xì)胞定位
        一、 CgTNF-1 mRNA 在長牡蠣組織中的分布
        二、 CgTNF-1 在長牡蠣細(xì)胞中的定位
    第四節(jié) LPS 刺激后牡蠣血淋巴中 CgTNF-1 基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的時序變化
        一、 LPS 刺激后血淋巴細(xì)胞中 CgTNF-1mRNA 表達(dá)水平的時序變化
        二、 LPS 刺激后牡蠣血淋巴上清中 CgTNF-1 蛋白表達(dá)量的時序變化
    第五節(jié) LPS 和 CgTNF-1 處理對牡蠣血淋巴中相關(guān)免疫指標(biāo)的影響
        一、 CgTNF-1 分子注射劑量的確定
        二、 LPS 和 CgTNF-1 處理后牡蠣血淋巴細(xì)胞凋亡和吞噬率的時序變化
        三、 LPS 和 CgTNF-1 處理后牡蠣血淋巴上清中 NO、相關(guān)酶活性以及抗菌能力的時序變化
    第六節(jié) CgTNF-1 對細(xì)胞增殖的影響
    第七節(jié) CgTNF-1 的 PAMPs 結(jié)合活性分析
第四章 分析與討論
    第一節(jié) 牡蠣中腫瘤壞死因子的基本特征及分布
        一、 CgTNF-1 分子的基本特征
        二、 CgTNF-1 在牡蠣組織中的分布以及在血淋巴細(xì)胞中的定位
    第二節(jié) 免疫刺激能夠誘導(dǎo) CgTNF-1 的表達(dá)
    第三節(jié) CgTNF-1 對牡蠣免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用
        一、 CgTNF-1 分子注射劑量的確定
        二、 CgTNF-1 對牡蠣細(xì)胞免疫的影響
        三、 CgTNF-1 對牡蠣體液免疫的影響
    第四節(jié) CgTNF-1 對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及其 PAMPs 結(jié)合能力
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡歷
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本文編號：3798993