發(fā)布時間：2023-03-19 12:21

　　越來越多的研究表明,由病毒感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的組織損傷,是病毒重要的致病機制之一。而核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2related factor2, Nrf2)是機體在應(yīng)對氧化刺激時,啟動細胞防御體系的關(guān)鍵調(diào)控因子。由Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的下游效應(yīng)基因在細胞解毒,抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等方面發(fā)揮著重要作用；同時,也可能影響病毒的入侵、復(fù)制、組裝、釋放等過程。因此,有必要深入探討Nrf2與病毒的相互作用,以便為病毒性疾病的預(yù)防和治療提供新的解決策略。 本研究以黑頭軟口鰷上皮瘤細胞(Epithelioma Papulosum Cyprini, EPC)為實驗材料,克隆得到黑頭軟口鰷(Pimephales promelas) Nrf2基因的全長cDNA。以此為基礎(chǔ),在細胞水平上,探討了鯉春病毒血癥病毒(SVCV)感染對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)錄和表達的影響以及Nrf2的激活對SVCV復(fù)制水平的影響。主要結(jié)論如下： 1.黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA的克隆及系統(tǒng)進化分析 利用反轉(zhuǎn)錄-PCR及3’/5’-RACE技術(shù)從EPC細胞中克隆得到了黑頭軟口鰷Nrf2...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 Nrf2與Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
        1.1 核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2
        1.2 Nrf2的Keap1依賴型調(diào)控方式
        1.3 Nrf2的Keap1非依賴型調(diào)控方式
        1.4 Nrf2/ARE防御通路中的效應(yīng)基因
    2 Nrf2與病毒相關(guān)性研究
        2.1 病毒感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激
        2.2 病毒感染對Nrf2表達的影響
        2.3 Nrf2的表達對病毒感染的影響
    3 Nrf2的小分子激活劑
    4 抗氧化策略在抗病毒感染中的應(yīng)用
    5 本研究的目的與意義
第二章 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA克隆與系統(tǒng)進化分析
    1 材料與方法
        1.1 細胞、菌株和載體
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 EPC細胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)
        1.5 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA核心片段的克隆
            1.5.1 引物設(shè)計
            1.5.2 EPC細胞總RNA提取
            1.5.3 第一鏈cDNA的合成
            1.5.4 巢式PCR擴增Nrf2基因的核心片段
            1.5.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化
            1.5.6 大腸桿菌感受態(tài)的制備
            1.5.7 PCR產(chǎn)物的T載體克隆與測序
        1.6 Nrf2基因cDNA 3’末端的克隆
            1.6.1 引物設(shè)計
            1.6.2 3’-RACE擴增Nrf2基因cDNA3’末端
            1.6.3 PCR產(chǎn)物的T載體克隆與測序
        1.7 Nrf2基因cDNA5’末端的克隆
            1.7.1 引物設(shè)計
            1.7.2 5’-RACE擴增Nrf2基因cDNA 5’末端
            1.7.3 PCR產(chǎn)物的T載體克隆與測序
        1.8 Nrf2基因序列分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA核心片段的克隆和序列測定
        2.2 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA 3’-末端的克隆和序列測定
        2.3 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA 5’-末端的克隆和序列測定
        2.4 黑頭軟口鰷Nrf2基因cDNA序列分析
        2.5 黑頭軟口鰷Nrf2的同源性及系統(tǒng)進化分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 SVCV感染與Nrf2表達策略分析
    1 材料與方法
        1.1 細胞和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 實時熒光定量分析SVCV感染EPC細胞在不同時相下Nrf2的基因表達水平
            1.4.1 病毒感染
            1.4.2 RNA的提取
            1.4.3 反轉(zhuǎn)錄
            1.4.4 半定量PCR檢測SVCV-G mRNA的表達
            1.4.5 Real-time PCR檢測SVCV感染EPC細胞在不同時相下Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況
        1.5 Western blot分析SVCV感染EPC細胞在不同時相下Nrf2的蛋白表達水平
            1.5.1 病毒感染
            1.5.2 細胞總蛋白的樣品制備
            1.5.3 細胞核蛋白的樣品制備
            1.5.4 SDS-PAGE及Western blot分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 半定量PCR檢測SVCV-G基因的表達
        2.2 SVCV感染上調(diào)Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平
        2.3 SVCV感染誘導(dǎo)Nrf2在細胞核內(nèi)的累積
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 Nrf2的激活對下游效應(yīng)基因的調(diào)控及對SVCV感染的影響
    1 材料與方法
        1.1 細胞和病毒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 實驗方法
            1.4.1 MTT法測定藥物毒性
            1.4.2 激活劑對Nrf2及其下游效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和表達的影響
            1.4.3 FRAP法測定激活劑處理后的細胞總抗氧化能力
            1.4.4 激活劑預(yù)處理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量檢測
    2 結(jié)果與分析
        2.1 MTT法測定藥物毒性
        2.2 激活劑對Nrf2及其下游效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和表達的影響
        2.3 FRAP法測定激活劑處理后的細胞總抗氧化能力
        2.4 激活劑預(yù)處理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量檢測
    3 討論
    4 小結(jié)
參考文獻
附表Ⅰ：實驗中主要試劑的配制方法
附表Ⅱ：碩士期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3765238