肌肉內(nèi)的脂肪含量在調(diào)控魚類肌肉品質(zhì)上發(fā)揮著重要作用,在一定范圍內(nèi)如何增加肌肉內(nèi)的脂肪含量來達到改善肌肉的嫩度和風味等特性的目的是養(yǎng)殖業(yè)中熱門的研究課題之一。肌肉生長抑制素myostatin屬于轉化生長因子β（TGFβ）超家族中的一員,負調(diào)控動物體骨骼肌的生長發(fā)育水平。前人研究證實mstn參與調(diào)控骨骼肌等組織中的多種代謝過程如脂肪代謝、糖代謝等。本實驗重點研究mstn參與肌肉內(nèi)脂肪代謝過程相關機制及功能作用。通過構建mstn敲除型泥鰍和構建mstn敲降胖頭鯉細胞系模型,從活體和離體兩方面來研究肌肉組織及肌肉細胞中脂肪代謝的情況來探究mstn在其中發(fā)揮的作用,并通過實時定量PCR、蛋白免疫印跡、Oil Red O染色、H&E染色、脂質(zhì)組學研究等多種生化、細胞和分子檢測方法研究其作用與機制。獲得的主要結果如下:（1）.mstn基因缺失能顯著促進肌肉組織發(fā)育,但在促進肌肉組織發(fā)育的同時,會減少肌肉組織中的脂肪合成,LC-MS分析表明mstn缺失顯著影響了泥鰍肌肉組織中的脂質(zhì)組分,甘油三酯含量顯著減少,此外,還發(fā)現(xiàn)mstn缺失型泥鰍肌肉組織中ATP含量明顯低于野生型,因此猜測mstn調(diào)控... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

泥鰍mstn基因（mRNA）不同組織中的表達分析

mstn基因降低魚類脂肪沉積的作用研究17蛋白質(zhì)的編碼產(chǎn)生的影響可能更大，具體的靶位點序列如下：靶位點：5’-GGACCAGTACGGTGTGCTGG-3’靶位點與一段特定的序列結合合成特異性gRNA的PCR正向引物，序列如下：gRNA-F：TGTAATACGACTCACTATAGGACCAGTACGGTGTGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATgRNA-R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA3.2.2敲除模型的成功構建如圖2.2為泥鰍mstn的突變模型，靶位點設計于第一外顯子，通過PCR產(chǎn)物測序篩選泥鰍突變類型，測序峰圖如圖顯示，該突變是mstn基因第一個外顯子核苷酸位置287的T到G過渡，使得MSTN蛋白第95位密碼子的翻譯過早導致突變，我們將此種突變定義為MU。圖2.2通過CRISPR/Cas9技術構建泥鰍mstn突變模型Fig2.1MSTN-depletionloaches(MUforshort)producedbyCRISPR/Cas93.3qPCR和WesternBlot檢測mstn基因表達為了分析mstn基因的敲除效果，通過在cDNA序列上設計定量引物及自制兔多克隆抗體分別從mRNA及蛋白水平檢測了mstn基因表達情況，檢測結果如圖2.3所示。從qPCR結果分析得出與對照組野生型泥鰍相比，MU泥鰍mstn基因mRNA的表達量顯著降低（2.3A）；Westernblot結果也證明了MU型泥鰍mstn基因的蛋白表達量顯著低于對照組（2.3B）。檢測結果分析表示我們成功獲得了mstn基因敲除的二倍體泥鰍模型。

華中農(nóng)業(yè)大學2020屆碩士研究生學位論文18AB圖2.3mstn基因mRNA和蛋白水平的表達分析。（A）MU與WT泥鰍肌肉組織mstn基因的mRNA的表達分析；（B）WesternBlot分析敲除型與野生型泥鰍肌肉組織中mstn基因蛋白的表達。Fig2.3(A)TranscriptionalexpressionlevelsofmusclemstninWT(F1wild-typeloaches)andMU.(B)MSTNproteinlevelsinmuscletissuesofWTandMU.3.4mstn缺失對泥鰍生長發(fā)育的影響將mstn缺失的突變型泥鰍與野生型對照組泥鰍按照嚴格統(tǒng)一的方式養(yǎng)殖，每15尾養(yǎng)殖于15L的白色魚缸中，保持28°C循環(huán)水喂養(yǎng)，光/暗周期為14h/10h，一日三次投喂，定時定量投喂鮮活水蚯蚓，定期換水，分別在30d、60d、90d、120d生長期下記錄泥鰍體長體重情況，并做好拍照工作，從結果可以發(fā)現(xiàn)，mstn缺失型泥鰍的肌肉發(fā)育程度顯著強于對照組泥鰍，90d時的對比情況如圖2.4A所示。與此同時，mstn缺失對泥鰍體長并無顯著影響，但是對體重以及體高有著明顯的促進作用，如果2.4B所示。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3107417