肌肉內(nèi)的脂肪含量在調(diào)控魚類肌肉品質(zhì)上發(fā)揮著重要作用,在一定范圍內(nèi)如何增加肌肉內(nèi)的脂肪含量來達(dá)到改善肌肉的嫩度和風(fēng)味等特性的目的是養(yǎng)殖業(yè)中熱門的研究課題之一。肌肉生長抑制素myostatin屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）超家族中的一員,負(fù)調(diào)控動物體骨骼肌的生長發(fā)育水平。前人研究證實mstn參與調(diào)控骨骼肌等組織中的多種代謝過程如脂肪代謝、糖代謝等。本實驗重點研究mstn參與肌肉內(nèi)脂肪代謝過程相關(guān)機(jī)制及功能作用。通過構(gòu)建mstn敲除型泥鰍和構(gòu)建mstn敲降胖頭鯉細(xì)胞系模型,從活體和離體兩方面來研究肌肉組織及肌肉細(xì)胞中脂肪代謝的情況來探究mstn在其中發(fā)揮的作用,并通過實時定量PCR、蛋白免疫印跡、Oil Red O染色、H&E染色、脂質(zhì)組學(xué)研究等多種生化、細(xì)胞和分子檢測方法研究其作用與機(jī)制。獲得的主要結(jié)果如下:（1）.mstn基因缺失能顯著促進(jìn)肌肉組織發(fā)育,但在促進(jìn)肌肉組織發(fā)育的同時,會減少肌肉組織中的脂肪合成,LC-MS分析表明mstn缺失顯著影響了泥鰍肌肉組織中的脂質(zhì)組分,甘油三酯含量顯著減少,此外,還發(fā)現(xiàn)mstn缺失型泥鰍肌肉組織中ATP含量明顯低于野生型,因此猜測mstn調(diào)控... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

泥鰍mstn基因（mRNA）不同組織中的表達(dá)分析

mstn基因降低魚類脂肪沉積的作用研究17蛋白質(zhì)的編碼產(chǎn)生的影響可能更大，具體的靶位點序列如下：靶位點：5’-GGACCAGTACGGTGTGCTGG-3’靶位點與一段特定的序列結(jié)合合成特異性gRNA的PCR正向引物，序列如下：gRNA-F：TGTAATACGACTCACTATAGGACCAGTACGGTGTGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATgRNA-R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA3.2.2敲除模型的成功構(gòu)建如圖2.2為泥鰍mstn的突變模型，靶位點設(shè)計于第一外顯子，通過PCR產(chǎn)物測序篩選泥鰍突變類型，測序峰圖如圖顯示，該突變是mstn基因第一個外顯子核苷酸位置287的T到G過渡，使得MSTN蛋白第95位密碼子的翻譯過早導(dǎo)致突變，我們將此種突變定義為MU。圖2.2通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建泥鰍mstn突變模型Fig2.1MSTN-depletionloaches(MUforshort)producedbyCRISPR/Cas93.3qPCR和WesternBlot檢測mstn基因表達(dá)為了分析mstn基因的敲除效果，通過在cDNA序列上設(shè)計定量引物及自制兔多克隆抗體分別從mRNA及蛋白水平檢測了mstn基因表達(dá)情況，檢測結(jié)果如圖2.3所示。從qPCR結(jié)果分析得出與對照組野生型泥鰍相比，MU泥鰍mstn基因mRNA的表達(dá)量顯著降低（2.3A）；Westernblot結(jié)果也證明了MU型泥鰍mstn基因的蛋白表達(dá)量顯著低于對照組（2.3B）。檢測結(jié)果分析表示我們成功獲得了mstn基因敲除的二倍體泥鰍模型。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位論文18AB圖2.3mstn基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)分析。（A）MU與WT泥鰍肌肉組織mstn基因的mRNA的表達(dá)分析；（B）WesternBlot分析敲除型與野生型泥鰍肌肉組織中mstn基因蛋白的表達(dá)。Fig2.3(A)TranscriptionalexpressionlevelsofmusclemstninWT(F1wild-typeloaches)andMU.(B)MSTNproteinlevelsinmuscletissuesofWTandMU.3.4mstn缺失對泥鰍生長發(fā)育的影響將mstn缺失的突變型泥鰍與野生型對照組泥鰍按照嚴(yán)格統(tǒng)一的方式養(yǎng)殖，每15尾養(yǎng)殖于15L的白色魚缸中，保持28°C循環(huán)水喂養(yǎng)，光/暗周期為14h/10h，一日三次投喂，定時定量投喂鮮活水蚯蚓，定期換水，分別在30d、60d、90d、120d生長期下記錄泥鰍體長體重情況，并做好拍照工作，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，mstn缺失型泥鰍的肌肉發(fā)育程度顯著強(qiáng)于對照組泥鰍，90d時的對比情況如圖2.4A所示。與此同時，mstn缺失對泥鰍體長并無顯著影響，但是對體重以及體高有著明顯的促進(jìn)作用，如果2.4B所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3107417